光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，包括平板培养基培养，试管培养，三角瓶培养，二级种子的制备，三级种子的制备，成品的制备等步骤。采用低浓度的有机培养基诸如蛋白胨、酵母膏及氮磷钾盐保证了培养出的光合细菌颜色纯正，亮丽，不会变淡、变绿、变黑等；采用低浓度的氮源和碳源保证了低成本，更能适于工业化大规模生产；光合细菌生长速度快，菌液浓度高；其制备工艺简单并易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，后加工成本低，生产环境友好。
【专利说明】光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]目前固态微生态制剂特别是光合细菌固态微生态的制剂方法通常有两种工艺技术方案，一种是先进行液态深层发酵，最后加入固态载体吸附，干燥而成；而液态发酵培养虽可得到较纯菌体，但成本高，发酵易受产物反馈控制，难以得到高浓度菌株，所以该方法有效菌数含量较低；另一种是常规固态发酵的模式；但现有的这些技术工艺方法普遍存在着工艺步骤复杂，制备成本高，产品收率低、杂菌含量高等缺点。
[0005]
【发明内容】
[0006]为了克服现有【技术领域】存在的上述缺陷，本发明的目的在于，提供一种光和细菌液固双重发酵高密度微 生态制剂的制备方法，解决现有技术光合细菌固态微生态的制剂方法存在成本高，难以得到高浓度菌株，有效菌数含量较低，工艺复杂，杂菌含量高的问题。
[0007]本发明提供的光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，包括以下步骤:
一、平板培养，光合细菌保存菌种划线接种至平板培养基，121°C灭菌30分钟，32°C培养 24h ；
二、试管接种，取发育健壮、菌落典型的菌株接种10ml，12rC灭菌30分钟，32°C培养
24h ；
三、三角瓶接种100ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h；
四、三角瓶接种1000ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h；
五、二级种子的制备，将光合细菌于30°C，通气量为0.24m3/h条件下培养24h，得二级菌种9L ；
六、三级种子的制备，先向500L的液体发酵灌内加入100L饮用水，将称量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸钠180g，碳酸氢钠180g，氯化铵180g，氯化镁180g，磷酸氢二钾180g，葡萄糖3.6kg投入到发酵灌，搅拌10分钟至全部溶解，然后停止搅拌，加饮用水至180L，定完液位后，开启搅拌，然后打开蒸汽阀升温至100°C，排冷空气，排掉冷空气后继续升温至121°C保持30分钟，灭菌结束，冷却，备用，当培养基冷却至30°C，将光合细菌二级种子9L通过压差接种的方式，接种到500L发酵罐中，300C，通气量为9.6m3/h条件下发酵48h，得三级菌种约200L ；七、将固体基质和培养基原料加入到固体发酵罐中，1.0MPa, 121°C灭菌半小时，等培养基冷却至30°C时，将液体菌种与固体发酵基质按4:10混合，将混合均匀的固体发酵料盛入发酵浅盘，铺料厚度4一5cm左右，置于发酵间，使发酵料好氧发酵，室温保持在30°C左右，发酵时间为6天左右，发酵期间每天翻盘两次。
[0008]所述步骤一或二或三或四中所用培养基均是由0.5g蛋白胨，0.5g酵母膏，1.0g乙酸钠，1.0g碳酸氢钠，1.0g氯化铵，0.5g氯化镁，1.0g磷酸氢二钾，15g琼脂，1000ml蒸馏水配置而成，PH值为7 ;所述步骤七中固体基质是由500kg花生壳或棉籽壳，150kg玉米粉，200kg豆柏粉，IOOkg麸皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成的。
[0009]本发明提供的光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，其有益效果在于，本发明中培养基PH值不随着培养时间的延长而升高，始终保持在5.5—7.5之间，不会抑制光合细菌的生长；采用低浓度的有机培养基诸如蛋白胨、酵母膏及氮磷钾盐保证了培养出的光合细菌颜色纯正，亮丽，不会变淡、变绿、变黑等；采用低浓度的氮源和碳源保证了低成本，更能适于工业化大规模生产；光合细菌生长速度快，菌液浓度高；其制备工艺简单并易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，后加工成本低，生产环境友好。
[0010]
【具体实施方式】
[0011 ] 下面结合一个实施例，对本发明提供的光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法进行详细的说明。
[0012]
实施例
[0013]本实施例的光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，包括以下步骤:
一、平板培养，光合细菌保存菌种划线接种至平板培养基，121°C灭菌30分钟，32°C培养 24h ；
二、试管接种，取发育健壮、菌落典型的菌株接种10ml，12rC灭菌30分钟，32°C培养
24h ；
三、三角瓶接种100ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h；
四、三角瓶接种1000ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h；
五、二级种子的制备，将光合细菌于30°C，通气量为0.24m3/h条件下培养24h，得二级菌种9L ；
六、三级种子的制备，先向500L的液体发酵灌内加入100L饮用水，将称量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸钠180g，碳酸氢钠180g，氯化铵180g，氯化镁180g，磷酸氢二钾180g，葡萄糖3.6kg投入到发酵灌，搅拌10分钟至全部溶解，然后停止搅拌，加饮用水至180L，定完液位后，开启搅拌，然后打开蒸汽阀升温至100°C，排冷空气，排掉冷空气后继续升温至121°C保持30分钟，灭菌结束，冷却，备用，当培养基冷却至30°C，将光合细菌二级种子9L通过压差接种的方式，接种到500L发酵罐中，300C，通气量为9.6m3/h条件下发酵48h，得三级菌种约200L，总含菌量达到1.3X 109cfu/mL。[0014]七、将固体基质和培养基原料加入到固体发酵罐中，1.0MPa，121°C灭菌半小时，等培养基冷却至30°C时，将液体菌种与固体发酵基质按4:10混合，将混合均匀的固体发酵料盛入发酵浅盘，铺料厚度4一5cm左右，置于发酵间，使发酵料好氧发酵，室温保持在30°C左右，发酵时间为6天左右，发酵期间每天翻盘两次。
[0015]所述步骤一或二或三或四中所用培养基均是由0.5g蛋白胨,0.5g酵母膏，1.0g乙酸钠，1.0g碳酸氢钠，1.0g氯化铵，0.5g氯化镁，1.0g磷酸氢二钾，15g琼脂，1000ml蒸馏水配置而成，PH值为7 ;所述步骤七中固体基质是由500kg花生壳或棉籽壳，150kg玉米粉，200kg豆柏粉，100kg麸皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成。
【权利要求】
1.一种光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 一、平板培养，光合细菌保存菌种划线接种至平板培养基，121°c灭菌30分钟，32°C培养 24h ； 二、试管接种，取发育健壮、菌落典型的菌株接种10ml，12rC灭菌30分钟，32°C培养24h ； 三、三角瓶接种100ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h； 四、三角瓶接种1000ml，121°C灭菌30分钟，32°C培养24h； 五、二级种子的制备，将光合细菌于30°C，通气量为0.24m3/h条件下培养24h，得二级菌种9L ； 六、三级种子的制备，先向500L的液体发酵灌内加入100L饮用水，将称量好的蛋白胨90g，酵母膏90g，乙酸钠180g，碳酸氢钠180g，氯化铵180g，氯化镁180g，磷酸氢二钾180g，葡萄糖3.6kg投入到发酵灌，搅拌10分钟至全部溶解，然后停止搅拌，加饮用水至180L，定完液位后，开启搅拌，然后打开蒸汽阀升温至100°C，排冷空气，排掉冷空气后继续升温至121°C保持30分钟，灭菌结束，冷却，备用，当培养基冷却至30°C，将光合细菌二级种子9L通过压差接种的方式，接种到500L发酵罐中，300C，通气量为9.6m3/h条件下发酵48h，得三级菌种约200L ； 七、将固体基质和培养基原料加入到固体发酵罐中，1.0MPa, 121°C灭菌半小时，等培养基冷却至30°C时，将液体菌种与固体发酵基质按4:10混合，将混合均匀的固体发酵料盛入发酵浅盘，铺料厚度4一5cm左右，置于发酵间，使发酵料好氧发酵，室温保持在30°C左右，发酵时间为6天左右，发酵期间每天翻盘两次。
2.根据权利要求1所述的光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤一或二或三或四中所用培养基均是由0.5g蛋白胨，0.5g酵母膏，1.0g乙酸钠，1.0g碳酸氢钠，1.0g氯化铵，0.5g氯化镁，1.0g磷酸氢二钾，15g琼脂，1000ml蒸馏水配置而成，PH值为7。
3.根据权利要求1所述的 光和细菌液固双重发酵高密度微生态制剂的制备方法，其特征在于:所述步骤七中固体基质是由500kg花生壳或棉籽壳，150kg玉米粉,200kg豆柏粉，IOOkg麸皮,5kg葡萄糖,200kg水配置而成的。
【文档编号】C12N1/20GK103881937SQ201210556654
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】张述智, 夏伟, 朱绍辉, 张 浩, 王晓丽, 徐权汗, 李之详, 许团辉 申请人:青岛中仁药业有限公司