杂交瘤细胞的培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种杂交瘤细胞的培养方法，包括如下步骤：将杂交瘤细胞悬液接种到含有大孔微载体和培养基的搅拌瓶中并于搅拌条件下培养，得到生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞；将生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞在搅拌瓶中逐级放大培养，同时逐渐降低培养基中血清的含量直至为零，得到适应无血清培养基的杂交瘤细胞；采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，得到密度大于1×107细胞/mL的适应无血清培养基的杂交瘤细胞，即具有高细胞密度的杂交瘤细胞。
【专利说明】杂交瘤细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养【技术领域】，特别是涉及一种杂交瘤细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]动物细胞能够生产许多重要的生物制品，而大规模动物细胞培养是生产重组蛋白治疗药物的有效途径，因此，大规模动物细胞培养技术已成为生物制药领域最重要的关键技术之一。
[0003]传统工业化生产动物细胞表达重组蛋白治疗药物的主要方法是通过利用各种动物细胞培养反应器，在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞、昆虫细胞、微生物等,再通过相关的纯化手段浓缩纯化制备重组蛋白产品。其中，高密度培养动物细胞是高效获得大量重组蛋白治疗药物的关键。
[0004]传统的微载体杂交瘤细胞培养反应器多集中在机械搅拌式反应器的研究，该类反应器存在机械剪切力力，结构复杂，不易密封，放大培养困难；而且气泡与细胞直接接触也不利于细胞的贴壁生长。培养过程中杂交瘤细胞的细胞密度也不够理想，限制了杂交瘤细胞在大规模工业化生产重组蛋白治疗药物中的应用。
【发明内容】
[0005]基于此，有必要提供一种具有高细胞密度的杂交瘤细胞的培养方法。
[0006]一种杂交瘤细胞的培养方法，包括如下步骤:
[0007]将杂交瘤细胞悬液接种到含有大孔微载体和培养基的搅拌瓶中搅拌培养，得到生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞，其中，培养条件为:培养基的PH为7.0-7.2，培养基中血清的质量分数为5%，培养温度37°C，溶氧的质量分数为30%，CO2的质量分数为5%，培养基中大孔微载体的浓度为1.2^1.5g/L，搅拌速率为20-40转/分钟；
[0008]将生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞在搅拌瓶中逐级放大培养，同时逐渐降低培养基中血清的含量直至为零，然后加入胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6，继续培养，得到适应无血清培养基的杂交瘤细胞；
[0009]当上述适应无血清培养基的杂交瘤细胞的密度达到I X IO6~1.2 X IO6细胞/mL时，将所述适应无血清培养基的杂交瘤细胞接种到通气搅拌生物反应器中，采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，得到密度大于I X IO7细胞/mL的杂交瘤细胞，其中，通气搅拌生物反应器中预先加入了大孔微载体、培养基、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6，培养条件为:培养基的PH为7.0-7.2，搅拌速率为70-90转/分钟，灌流速率为1.5升/天，溶氧的质量分数为30%，培养基中大孔微载体的浓度为1.5^3.0g/mL。
[0010]在其中一个实施例中，还包括在使用大孔微载体之前对所述大孔微载体进行预处理的步骤，具体如下:[0011]将大孔微载体置于磷酸盐缓冲液中浸泡使其膨胀；用磷酸盐缓冲液洗涤膨胀后的大孔微载体，并高压灭菌，然后在无菌环境下除去磷酸盐缓冲液，然后用培养基洗涤后置于4°c备用。
[0012]在其中一个实施例中，还包括在得到密度大于IXlO7细胞/mL的杂交瘤细胞后，采用连续灌流的培养方式于无血清表达型培养基中培养密度大于IX IO7细胞/mL的杂交瘤细胞的步骤。
[0013]在其中一个实施例中，还包括在无血清生长型培养基中培养杂交瘤细胞过程中采用细胞截留装置除去通气搅拌生物反应器中死细胞、细胞碎片以及自溶物的步骤。
[0014]在其中一个实施例中，所述杂交瘤细胞为用于生产抗人A型血细胞表面抗原的单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞。
[0015]在其中一个实施例中，所述大孔微载体为纤维素大孔微载体、明胶大孔微载体或胶原大孔微载体。
[0016]在其中一个实施例中，细胞的密度是由高效液相色谱法、酶法测定葡萄糖消耗速率或酶法测定乳酸生成速率确定。
[0017]在其中一个实施例中，所述微量元素为铁、镁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、氟、硼及砷；所述氨基酸为苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸。
[0018]由于杂交瘤细胞属于半贴壁细胞，为了增加其培养密度，一般需将其固定化。而细胞的悬浮培养方法相对于细胞的贴壁培养方法具有很多优点，如，传代时无需胰酶消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可在线连续直接检测细胞密度。
[0019]而上述杂交瘤细胞的培养方法，首先，采用大孔微载体细胞固定化技术将杂交瘤细胞固定在大孔微载体上，再通过逐级放大培养技术增加杂交瘤细胞的培养密度，然后将达到一定细胞密度的杂交瘤细胞转入通气搅拌生物反应器中，并采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，从而获得具有更高细胞密度的杂交瘤细胞。同时在细胞培养基中加入人重组白细胞介素IL-6，进一步提高杂交瘤细胞的细胞密度，杂交瘤细胞的细胞密度通常可以达到大于IXlO7细胞/mL。而且具体试验的检测数据表明，杂交瘤细胞的细胞密度可以达到1.5 X IO7细胞/mL，活细胞比例可维持在90%左右，培养上清液中蛋白产品的滴度一般可达1:150000，整个培养时间可维持在2个月以上。因此上述培养方法能培养出具有高细胞密度的杂交瘤细胞，从而获得高产量的蛋白产品。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为一实施方式的杂交瘤细胞的培养方法的流程图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图及具体实施例对杂交瘤细胞的培养方法进行进一步的说明。
[0022]如图1所示，一实施方式的杂交瘤细胞的培养方法，包括如下步骤:
[0023]步骤110，将杂交瘤细胞悬液接种到含有大孔微载体和培养基的搅拌瓶中并于搅拌条件下培养，得到生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞，其中，培养条件为:培养基的PH为
7.0-7.2，培养基中血清的质量分数为5%，培养温度37°C，溶氧的质量分数为30%，CO2的质量分数为5%，培养基中大孔微载体的浓度为1.2^1.5g/L，搅拌速率为20-40转/分钟。
[0024]步骤120，将生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞在搅拌瓶中逐级放大培养，同时逐渐降低培养基中血清的含量直至为零，然后加入胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6 (rhIL-6)，继续培养，得到适应无血清培养基的杂交瘤细胞。
[0025]步骤130，将密度为I X 10^1.2 X IO6细胞/mL的适应无血清培养基的杂交瘤细胞接种到通气搅拌生物反应器中，并采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，得到密度大于I X IO7细胞/mL的适应无血清培养基的杂交瘤细胞，其中，通气搅拌生物反应器中预先加入了大孔微载体、培养基、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6，培养条件为:培养基的pH为
7.0-7.2，搅拌速率为70-90转/分钟，灌流速率为1.5升/天，溶氧的质量分数为30%，培养基中大孔微载体的浓度为1.5^3.0g/mL。
[0026]在本实施方式中，杂交瘤细胞为生产抗人A型血细胞表面抗原的单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞。当然，也可以是其他种类的杂交瘤细胞。
[0027]在本实施方式中，还包括对所述大孔微载体进行预处理的步骤，具体如下:
[0028]将大孔微载体置于磷酸盐缓冲液中浸泡使其膨胀；用磷酸盐缓冲液洗涤膨胀后的大孔微载体，并高压灭菌，然后在无菌环境下除去磷酸盐缓冲液，然后用培养基洗涤后置于4°C备用。
[0029]在本实施方式中，大孔微载体为纤维素大孔微载体。大孔微载体可用于填充床、流化床、搅拌等生化反应器，且在灌流反应器中可保持数月的良好生产力，能在降低培养基血清含量的同时保证细胞和目的产物的产量。当然也可以是其他种类的大孔微载体，如明胶大孔微载体、胶原大孔微载体等。
[0030]在杂交瘤细胞的培养过程中，杂交瘤细胞的细胞密度是一个非常重要的数据，杂交瘤细胞的细胞密度可以用来确定细胞处于的生长期、指导培养者适时更换培养液等。在本实施方式中，采用酶法测定葡萄糖消耗速率，根据葡萄糖消耗速率分析确定杂交瘤细胞的细胞密度。当然，也可以采用高效液相色谱法测定葡萄糖消耗速率；还可以采用高效液相色谱法或酶法测定乳酸生成速率来分析确定杂交瘤细胞的细胞密度。
[0031]在细胞培养过程中，及时除去培养过程中产生的死细胞、细胞碎片、自溶物等，对细胞的正常生长非常重要。在本实施方式中，还包括采用细胞截留装置除去通气搅拌生物反应器中死细胞、细胞碎片以及自溶物的步骤。
[0032]在上述杂交瘤细胞的培养方法，无血清培养环节对于获得高细胞密度的杂交瘤细胞非常重要，但是血清中含有丰富的细胞生长必须的营养成份。因此，在本实施方式，无血清培养环节中需要补充细胞生长必须的营养成份，如胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、12种微量元素、8种必须氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6等。12种微量元素分别为铁、镁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、氟、硼及砷。8种必须氨基酸分别为苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸。
[0033]其中，各种物质在培养基中的浓度优选为5mg/L的胰岛素，5mg/L的转铁蛋白，2^5mg/L的乙醇胺，1~2.5mg/L的β巯基乙醇，2 μ g/L的氢化可的松、400U/mL的rhIL_6。
[0034]而培养杂交瘤细胞的最终目的是为了获得高产量的蛋白产品，因此，在本实施方式中，还包括采用连续灌流的培养方式与无血清表达型培养液培养密度大于IX IO7细胞/mL的适应无血清培养液的杂交瘤细胞的步骤。其中，无血清生长型培养基的配方为:RPM1-1640/F12 以 1:1 混合成 IL ;并加入 1.2g NaHC03，5mg 胰岛素，5mg 转铁蛋白，2_5mg乙醇胺，l-2.5mgi3巯基乙醇，2yg氢化可的松、12种微量元素，八种必须氨基酸，以及400U/mL 的 rhIL-6 ;用 15mMHEPES 调 pH 至 7.2-7.4 (其中 RPM1-1640, F12 均为商业化的基础培养基)。无血清表达型培养基的配方为:RPM1-1640/F12以1:1混合成IL ;并加入
1.2gNaHC03, 5mg胰岛素,5mg转铁蛋白，2_5mg乙醇胺，1-2.5mgP巯基乙醇，12种微量元素、八种必须氨基酸；用15mM HEPES调pH至7.2-7.4 (其中RPM1-1640、F12均为商业化的基础培养基)。上述培养基制备过程需要过滤除菌。
[0035]由于杂交瘤细胞属于半贴壁细胞，为了增加其培养密度，一般需将其固定化。而细胞的悬浮培养方法相对于细胞的贴壁培养方法具有很多优点，如，传代时无需胰酶消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害；细胞收率高，并可在线连续直接检测细胞密度。
[0036]而上述杂交瘤细胞的培养方法，首先，采用大孔微载体细胞固定化技术将杂交瘤细胞固定在大孔微载体上，再通过逐级放大培养技术增加杂交瘤细胞的培养密度，然后将达到一定细胞密度的杂交瘤细胞转入通气搅拌生物反应器中，并采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，从而获得具有更高细胞密度的杂交瘤细胞。同时在细胞培养基中加入人重组白细胞介素IL-6，进一步提高杂交瘤细胞的细胞密度，杂交瘤细胞的细胞密度通常可以达到大于I X IO7细胞/mL。而且具体试验的检测数据表明，杂交瘤细胞的细胞密度可以达到1.5 X IO7细胞/mL，活细胞比例可维持在90%左右，培养上清液中蛋白产品的滴度一般可达1:150000，整个培养时间可维持在2个月以上。因此上述培养方法能培养出具有高细胞密度的杂交瘤细胞，从而获得高产量的蛋白产品。
[0037]以下为具体实施例部分
[0038]将大孔微载体置于磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡3小时使其膨胀，除去PBS，然后用PBS洗涤膨胀后的大孔微载体3次，于121°C下高压灭菌30分钟，并于无菌环境下除去PBS ；然后用RPMI1640培养基洗涤2次后置于4°C备用。
[0039]提供培养于培养皿中的分泌抗人A型血细胞表面抗原的单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞，用培养基吹打多次得到鼠-鼠杂交瘤细胞的单细胞悬液；将鼠-鼠杂交瘤细胞的单细胞悬液接种到含有大孔微载体与RPMI1640培养基的搅拌瓶中并于搅拌条件下培养，其中，接种密度为5 X IO5细胞/mL，搅拌瓶中大孔微载体的浓度为1.5g/L，培养基中血清的质量分数为5%，培养温度37 °C，溶氧的质量分数为30%，CO2的质量分数为5%，搅拌速率为30转/分钟，让细胞较充分的与大孔微载体接触。培养5小时后，将搅拌速率提升至为50转/分钟，继续培养12小时，得到生长于大孔微载体上的鼠-鼠杂交瘤细胞。
[0040]将上述得到的生长于大孔微载体上的鼠-鼠杂交瘤细胞在搅拌瓶中逐级放大培养，培养条件为温度37°C，pH为7.0-7.2，转速为60转/分钟。培养3天后，用酶法测定培养基中葡萄糖的浓度，用新培养基置换搅拌瓶中一半的培养基，同时将培养基中的血清含量逐渐降到0，以驯化鼠-鼠杂交瘤细胞适应无血清培养基。然后加入5mg/L的胰岛素，5mg/L的转铁蛋白，4mg/L乙醇胺，2mg/L β巯基乙醇，2 μ g/L氢化可的松、12种微量元素以及八种必须氨基酸，并加入400U/mL的rhIL-6 (所有的浓度都是于培养基中的终浓度)，继续培养，得到适应无血清培养基的鼠-鼠杂交瘤细胞。[0041]将得到的适应无血清培养基的鼠-鼠杂交瘤细胞悬液直接接种到5L Celligen通气搅拌式反应器中培养，接种密度为I X IO6细胞/mL，采用连续灌流培养方式培养，先用无血清生长型培养基培养。培养条件为:pH为7.0±0.05、溶氧的质量分数为30%、温度为37.(TC ±0.1°C、搅拌转速为80转/分钟、大孔微载体的浓度为2.5g/L培养基；通气搅拌式反应器中预先加入了 5mg/L的胰岛素，5mg/L的转铁蛋白，4mg/L的乙醇胺，2mg/L的β巯基乙醇，2 μ g/L的氢化可的松、12种微量元素以及八种必须氨基酸,并加入400U/mL的rhIL_6(所有的浓度都是于培养基中的终浓度)。当细胞密度大于I X IO7细胞/mL后，改无血清表达型培养基培养，每天通过细胞截留系统换液广1.2个工作体积，将微载体截留在反应器中，收获含产品的上清液并加入等量新鲜培养基。
[0042]检测结果:上述Celligen通气搅拌式反应器中的细胞密度最高可达1.5X107细胞/mL ;活细胞比例维持在90%左右；培养上清液中抗体滴度可达1: 150000 ;整个培养时间可维持在2个月以上。
[0043]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发 明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 将杂交瘤细胞悬液接种到含有大孔微载体和培养基的搅拌瓶中搅拌培养，得到生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞，其中，培养条件为:培养基的PH为7.0-7.2，培养基中血清的质量分数为5%，培养温度37 °C，溶氧的质量分数为30%，CO2的质量分数为5%，培养基中大孔微载体的浓度为1.2^1.5g/L，搅拌速率为20-40转/分钟； 将生长于大孔微载体上的杂交瘤细胞在搅拌瓶中逐级放大培养，同时逐渐降低培养基中血清的含量直至为零，然后加入胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6，继续培养，得到适应无血清培养基的杂交瘤细胞； 当上述适应无血清培养基的杂交瘤细胞的密度达到1 X IO6^l.2 X IO6细胞/mL时，将所述适应无血清培养基的杂交瘤细胞接种到通气搅拌生物反应器中，采用连续灌流的培养方式培养，培养基为无血清生长型培养基，得到密度大于1 X IO7细胞/mL的杂交瘤细胞，其中，通气搅拌生物反应器中预先加入了大孔微载体、培养基、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β巯基乙醇、氢化可的松、微量元素、氨基酸以及人重组白细胞介素IL-6，培养条件为:培养基的PH为7.0-7.2，搅拌速率为70-90转/分钟，灌流速率为1.5升/天，溶氧的质量分数为30%，培养基中大孔微载体的浓度为1.5^3.0g/mL。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，还包括在使用大孔微载体之前对所述大孔微载体进行预处理的步骤，具体如下: 将大孔微载体置于磷酸盐缓冲液中浸泡使其膨胀；用磷酸盐缓冲液洗涤膨胀后的大孔微载体，并高压灭菌，然后在无菌环境下除去磷酸盐缓冲液，然后用培养基洗涤后置于4°C备用。
3.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，还包括在得到密度大于IX IO7细胞/mL的杂交瘤细胞后，采用连续灌流的培养方式于无血清表达型培养基中培养密度大于1 X IO7细胞/mL的杂交瘤细胞的步骤。
4.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，还包括在无血清生长型培养基中培养杂交瘤细胞过程中采用细胞截留装置除去通气搅拌生物反应器中死细胞、细胞碎片以及自溶物的步骤。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述杂交瘤细胞为用于生产抗人A型血细胞表面抗原的单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的杂交瘤细胞的培养方法,其特征在于,所述大孔微载体为纤维素大孔微载体、明胶大孔微载体或胶原大孔微载体。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，细胞的密度是由高效液相色谱法、酶法测定葡萄糖消耗速率或酶法测定乳酸生成速率确定。
8.根据权利要求1-4中任意一项所述的杂交瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述微量元素为铁、镁、铜、锌、钴、锰、铬、硒、碘、氟、硼及砷；所述氨基酸为苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸及苯丙氨酸。
【文档编号】C12N5/20GK103898041SQ201210572731
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】万晓春, 党利君, 金言 申请人:深圳先进技术研究院