修饰型α-葡萄糖苷酶及其用途

修饰型α-葡萄糖苷酶及其用途
【专利摘要】本发明的课题在于提供糖转移活性占主导的α-葡萄糖苷酶及其用途等。由α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中的选自以下中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列构成的修饰型α-葡萄糖苷酶:与序列号1所示的氨基酸序列的第385位、第491位、第535位、第450位、第534位、第537位、第538位、第554位、第556位、第630位、第683位或第689位的氨基酸相当的氨基酸，或者，与序列号2所示的氨基酸序列的第579位或第585位氨基酸相当的氨基酸。
【专利说明】修饰型Cl-葡萄糖苷酶及其用途【技术领域】
[0001]本发明涉及修饰型α-葡萄糖苷酶。更具体而言，涉及修饰型α-葡萄糖苷酶，修饰型α-葡萄糖苷酶的设计方法及制造方法，以及修饰型α-葡萄糖苷酶的用途。本申请主张基于2011年3月16日提出申请的日本专利申请第2011 — 057386号的优先权，通过参照而援引该专利申请的全部内容。
【背景技术】
[0002]糖水解酶是通过断裂酯键进行分解的酶，但同时大量报道了具有糖转移活性。可称为糖水解酶的代表的α-葡萄糖苷酶也通常具有水解活性(水解反应)和糖转移活性(缩合反应)。α-葡萄糖苷酶广泛存在于从微生物到高等动物以及高等植物的自然界。α -葡萄糖苷酶在产业上也是一种有用的酶，其可用于糖的降解和合成。
[0003]通过技术的进步，已经能够实现改变(改良)酶的特性。对于α -葡萄糖苷酶，也已作出多种改变的尝试(例如参照专利文献I?3)。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1:日本特开2003-88365号公报
[0007]专利文献2:日本特开2005-253302号公报
[0008]专利文献3:日本特开2009-22204号公报
[0009]专利文献4:日本特开.2001-046096号公报

【发明内容】

[0010]在产业用途中使用α -葡萄糖苷酶时，由于通常使用水解活性或糖转移活性中的任一个，因此优选不使用的活性低。将α-葡萄糖苷酶用于低聚糖的生产时，水解活性成为阻碍，低聚糖的生产效率降低。因此，本发明的课题在于提供适于低聚糖的生产、糖转移活性占主导的α-葡萄糖苷酶。另外，本发明的课题也在于提供其用途等。
[0011]本发明人等以设计提高低聚糖生产能力的新型酶为目的，已经尝试在分子水平上对现有的α-葡萄糖苷酶进行结构改变。具体而言，利用源自人小肠的α-葡萄糖苷酶(人麦芽糖酶-糖化酶)的X射线晶体结构分析结果，进行对计算机模拟以及与四种同源物的比对比较。其结果，确定了构成酶的底物口袋的三个位置的氨基酸。接下来，在黑曲霉的α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列上确定了与该氨基酸相当的氨基酸，在此基础上，将突变导入其中。研究得到的修饰体的特性，结果确认酶的特性得到了显著改变(特别是水解活性和糖转移活性的平衡)。在修饰体中，确认了不显示对α-1，4键和α_1，6键的水解活性的酶,对α-1，6键的水解活性显著降低的酶，对α-1,3键和α-1，6键的水解活性大幅降低的酶等。特别值得注意的是，野生型主要是生成在α-1，6位糖转移的低聚糖，与此相对，修饰体(W343M型和W343M/S496T型)仅生成在α-1，4位糖转移的低聚糖。这些事实意味着，以获得适用于低聚糖的生产等的α-葡萄糖苷酶(即，糖转移活性占主导的α-葡萄糖苷酶)为目的进行结构修饰时，作为导入突变的位置，成功确定了的上述氨基酸的位置是有效的。另外，该氨基酸的位置，可以说为了获得显示α-1，4位特异性糖转移活性的独特特性的α-葡萄糖苷酶而作为突变位置是特别有效的。另一方面，成功取得的修饰型α-葡萄糖苷酶其本身在工业生产中有很大的价值。
[0012]本发明人等进行了进一步的研究，使用新的方法研究了突变导入位点。具体而言，首先，使用其它计算机模拟软件，构建关于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶的立体结构模型。接下来，进行对接模拟分析，进行底物口袋的预测。然后，根据预测结果，检索作为活性中心的氨基酸，确定在各立体结构模型中的位置。然后，在黑曲霉的α -葡萄糖苷酶和构巢曲霉的α -葡萄糖苷酶之间比较氨基酸序列，将构成底物口袋的氨基酸中不一致的氨基酸确定为适于导入突变的氨基酸。接下来，为了确认这些氨基酸是否适合于导入突变(换而言之，是否是有益于结构修饰的氨基酸)，得到对两个氨基酸实际导入突变的修饰体。对得到的各修饰体的特性进行研究，结果发现了显示α?，6位特异性转移活性的修饰体、显示α 1，4位特异性转移活性的修饰体。这一事实证明，成功确定了的氨基酸位置对结构修饰是有效的。另一方面，成功获得的修饰型α-葡萄糖苷酶其本身在工业中有很大的价值。
[0013]另一方面，进一步研究的结果表明，成功获得的修饰体对低聚糖的生产乃至制造是有用的。值得注意的是，对于显示α?，6位特异性转移活性的修饰体，通过与野生型α-葡萄糖苷酶并用，也能够由具有α 1，4键的底物生成低聚糖。
[0014]另外，大量经验表明，通过将有效的两个氨基酸取代进行组合，取得相加的或相乘的效果的可能性高。因此，成功确定的三个突变位置不仅单独是有效的，其组合对特性的变化(特别是糖转移活性的提高)可以说也是有效的。事实上，在对两个位置的氨基酸取代进行组合的情形中，糖转移活性提高了(后述的实施例)。
[0015]另外，对于同种的酶，鉴于结构(一级结构、立体结构)相似性高，相同的突变产生相同的效果的可能性高这样的技术常识，本发明人等发现的突变技术不局限于后述实施例所示的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶，对其它生物来源的α-葡萄糖苷酶同样适用。
[0016]下面所示的本发明基于上述的成果和研究。
[0017][I] 一种修饰型α -葡萄糖苷酶，其特征在于，由α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中选自以下(I)?(14)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列构成:
[0018](I)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸；
[0019](2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸；
[0020](3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸；
[0021](4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸；
[0022](5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸；
[0023](6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸；
[0024](7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸；
[0025](8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸；
[0026](9)与序列号I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸；
[0027](10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸；[0028](11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸；
[0029](12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸；
[0030](13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸；
[0031](14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸。
[0032][2]根据[I]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，α _葡萄糖苷酶包括人类麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉 α _ 葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶体α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A),构巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、构巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、葱状被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或马铃薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
[0033][3]根据[I]所述的修饰型α -葡萄糖苷酶，其中，α -葡萄糖苷酶的序列为序列号2的氨基酸序列，(I)的氨基酸为该氨基酸序列第343位氨基酸；(2)的氨基酸为该氨基酸序列第452位氨基酸；(3)的氨基酸为该氨基酸序列第496位氨基酸；(4)的氨基酸为该氨基酸序列第410位氨基酸；(5)的氨基酸为该氨基酸序列第495位氨基酸；(6)的氨基酸为该氨基酸序列第498位氨基酸；(7)的氨基酸为该氨基酸序列第499位氨基酸；(8)的氨基酸为该氨基酸序列第531位氨基酸；(9)的氨基酸为该氨基酸序列第533位氨基酸；(12)的氨基酸为该氨基酸序列第662位氨基酸；(13)的氨基酸为该氨基酸序列第715位氨基酸；(14)的氨基酸为该氨基酸序列第721位氨基酸。
[0034][4]根据[3]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸，取代后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或异亮氨酸。
[0035][5]根据[3]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
[0036][6]根据[3]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或缬氨酸。
[0037][7]根据[3]所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，`其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是对于(I)的氨基酸为天冬氨酸，对于(2)的氨基酸为丙氨酸或甘氨酸。
[0038][8]根据[3]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是对于(I)的氨基酸为天冬氨酸或蛋氨酸，对于(3)的氨基酸为异亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。
[0039][9]根据[3]所述的修饰型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(5)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸。
[0040][10]根据[3]所述的修饰型α -葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(6)的氨基酸，取代后的氨基酸是亮氨酸或丝氨酸。
[0041][11]根据[I]所述的修饰型α -葡萄糖苷酶，其中，由序列号18?24以及77?78中的任意一个氨基酸序列构成。
[0042][12]根据[I]所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列号74?76中的任意一个氨基酸序列构成。
[0043][13] 一种编码[I]?[12]中任一项所述的修饰型α _葡萄糖苷酶的基因。
[0044][14]根据[13]所述的基因，含有序列号43?67以及79?83中的任意一个碱基序列。
[0045][15] 一种含有[13]或[14]所述的基因的重组DNA。
[0046][16] 一种具有[15]所述的重组DNA的微生物。
[0047][17] 一种含有[I]?[12]中任一项所述的修饰型α-葡萄糖苷酶的酶制剂。
[0048][18] 一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使[I]?[8]、[10]和[11]中的任一项所述的修饰型α-葡萄糖苷酶与具有α-1，4键的二糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
[0049][19] 一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使[9]或[12]所述的修饰α _葡萄糖苷酶与具有α-1，6键的二 糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
[0050][20]根据[18]或[19]所述的低聚糖的制造方法，其特征在于，与野生型的酶并用。
[0051][21] 一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使[9]或[12]所述的修饰型α-葡萄糖苷酶和野生型的酶、与具有α-1，4键的二糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
[0052][22]含有[I]?[12]中任一项所述的修饰型α -葡萄糖苷酶或[17]所述的酶制剂的医药组合物、准医药组合物、化妆品组合物、食品组合物或饵料组合物。
[0053][23] 一种修饰型α-葡萄糖苷酶的设计方法，其包含以下步骤(i )和(ii )，
[0054](i)在作为突变对象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，确定选自以下(I)?
(14)中的一个或两个以上氨基酸的步骤:
[0055](I)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸；
[0056](2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸；
[0057](3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸；
[0058](4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸；
[0059](5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸；
[0060](6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸；
[0061](7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸；
[0062](8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸；
[0063](9)与序列号I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸；
[0064](10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸；
[0065](11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸；[0066](12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸；
[0067](13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸；
[0068](14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸。
[0069](ii)以突变对象酶的氨基酸序列为基础，构建将步骤⑴中确定的氨基酸序列取代为其它氨基酸的氨基酸序列的步骤。
[0070][24]根据[23]所述的设计方法，其中，α-葡萄糖苷酶包括人麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶体α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、构巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、构巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、葱状被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或马铃薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
[0071][25]根据[23]所述的设计方法，其中，α -葡萄糖苷酶含有序列号I?17中任一个氨基酸序列。
.[0072][26]根据[23]所述的设计方法，其中，α _葡萄糖苷酶由序列号2的氨基酸序列构成，步骤(i )中被取代的氨基酸为选自⑴?(14)中的一个氨基酸、选自⑴?(14)中的两个氨基酸或选自(I)?(14)中的三个氨基酸。
[0073][27] 一种修饰型α -葡萄糖苷酶的制备方法，含有以下步骤(I )?(III):
[0074]( I )准备核酸的步骤，该核酸编码序列号18?42和74?78中的任意一个氨基酸序列或通过权利要求23?26中任一项所述的设计方法构建的氨基酸序列；
[0075]( II )使所述核酸表达的步骤；以及
[0076](III)回收表达产物的步骤。
[0077][28] 一种α -葡萄糖苷酶，其具有α _1，4位特异性或α _1，6位特异性转移活性。【专利附图】

【附图说明】
[0078]图1:人α -葡萄糖苷酶中突变导入点的位置㈧，比对比较(B)，黑曲霉的氨基酸序列中的与突变导入点对应的氨基酸位置(C)。
[0079]图2:使用酵母的结构修饰TG(转葡萄糖苷酶)筛查系统的概述。
[0080]图3:通过HPLC进行的低聚糖合成活性的比较。将WT(野生型)㈧和结构修饰TG (W343M (B)、V452G (C)、S496V (D))的低聚糖合成活性进行比较。
[0081]图4:三糖以上的低聚糖的合成量的比较。[0082]图5:三糖以上的低聚糖的合成量的比较(上图)和四糖以上的低聚糖的合成量的比较(下图)。在取代后的氨基酸(示于图的下方)不同的结构修饰TG之间，比较生成的低聚糖的量。
[0083]图6:三糖以上的低聚糖的合成量的比较(左图)和四糖以上的低聚糖的合成量的比较(右图)。在取代后的氨基酸(示于图的下方)不同的结构修饰TG之间，比较合成的低聚糖的量。
[0084]图7:与水解活性相关的底物特异性的比较。
[0085]图8:两个氨基酸取代所致的结构修饰TG的水解活性。
[0086]图9:两个氨基酸取代所致的结构修饰TG的低聚糖合成活性。将WT (野生型)(A)和结构修饰TG(W343M(B)、W343M/S496T (C)、W343D/V452G (D))的低聚糖合成活性进行比较。
[0087]图10:三糖以上的低聚糖的合成量的比较(左图)和四糖以上的低聚糖的合成量的比较(右图)。在取代后的氨基酸(示于图的下方)不同的结构修饰TG之间，比较合成的低聚糖的量。
[0088]图11:两个氨基酸取代所致的结构修饰TG的底物特异性。
[0089]图12:将麦芽五糖作为起始底物时生成的低聚糖的比较。
[0090]图13:将麦芽糖与异麦芽糖的混合物作为起始底物时生成的低聚糖的比较。
[0091]图14:计算机模拟的α-葡萄糖苷酶的立体结构模型。左图:黑曲霉的TG，右图:构巢曲霉的TG。
[0092]图15:基于计算机模拟的突变导入点的研究方案。
[0093]图16:结构修饰TG(S495X)的低聚糖合成活性的比较。底物使用麦芽糖。比较三糖以上的低聚糖的合成量(上图)和四糖以上的低聚糖的合成量(下图)。
[0094]图17:结构修饰TG(S495X)的低聚糖合成活性的比较。底物使用异麦芽糖。比较三糖以上的低聚糖的合成量(上图)和四糖以上的低聚糖的合成量(下图)。
[0095]图18:结构修饰TG(S495X)的水解活性。
[0096]图19:结构修饰TG的低聚糖合成活性的比较。底物使用麦芽五糖。(a)WT(野生型)的HPLC图谱。(b)结构修饰TG(S495V)的HPLC图谱。(c)生成的低聚糖的比例。
[0097]图20:结构修饰TG(C498X)的低聚糖合成活性的比较。底物使用麦芽糖。
[0098]图21:结构修饰TG(C498X)的水解活性。
[0099]图22:低聚糖合成能力的比较。(a)未添加TG的情形，(b)添加WT (野生型)的TG的情形，(c)添加结构修饰TG(W343M)的情形，(d)三糖以上的区域面积的比较。
[0100]图23:由粥(杉力4 )生产的低聚糖的HPLC图谱(反应开始90分钟后)。
[0101]图24:低聚糖合成活性的比较。对于结构修饰TG(S495P)单独的情形和与WT型并用的情形，比较三糖以上的低聚糖的合成量(上图)和四糖以上的低聚糖的合成量(下图)。底物使用麦芽糖。
[0102]图25:由麦芽糖(底物)生成的低聚糖的HPLC图谱(反应开始48小时后)。
[0103]图26:低聚糖合成能力的比较。(a)添加WT(野生型)的TG的情形，(b)添加结构修饰TG(S495P)的情形，(c)并用WT (野生型)与结构修饰TG(S495P)的情形，(d)三糖以上的区域面积的比较。[0104]图27:由粥产生的低聚糖的HPLC图谱(反应开始90分钟后)。
【具体实施方式】
[0105]为了说明方便，对本发明的所用术语的一部分做如下定义。
[0106](术语)
[0107]α-葡萄糖苷酶也被称为转葡萄糖苷酶。本申请说明书中，可以将“α-葡萄糖苷酶”和术语“转葡萄糖苷酶”交换使用。术语“修饰型α-葡萄糖苷酶”是指通过本说明书中公开的方法，对“成为基础的α -葡萄糖苷酶”修饰或突变而得到的酶。本说明书中，术语“修饰型α-葡萄糖苷酶”、术语“结构修饰α-葡萄糖苷酶”、术语“修饰酶”以及术语“结构修饰酶”可交换使用。成为基础的α-葡萄糖苷酶典型地为野生型的α-葡萄糖苷酶。然而，这并不妨碍将已经实施人为操作的α-葡萄糖苷酶作为“成为基础的α-葡萄糖苷酶”而适用于本发明。本说明书中，将“成为基础的α-葡萄糖苷酶”也称为“突变对象α-葡萄糖苷酶”或“突变对象酶”。在本说明书中，将表示氨基酸种类的一个字符和表示氨基酸位置的数字进行组合来表示突变导入点的氨基酸。例如，第343位色氨酸为突变导入点时，以“W343”表示。
[0108](修饰型α-葡萄糖苷酶)
[0109]本发明的第一方面涉及修饰型α -葡萄糖苷酶(修饰型酶)。本发明的修饰型酶具有在突变对象酶的氨基酸序列中选自以下(I)?(14)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列:
[0110](I)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸；
[0111](2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸；
[0112](3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸；
[0113](4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸；
[0114](5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸；
[0115](6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸；
[0116](7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸；
[0117](8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸；
[0118](9)与序列号I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸；
[0119](10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸；
[0120](11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸；
[0121](12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸；
[0122](13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸；
[0123](14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸。
[0124]如后述实施例所示，通过人麦芽糖酶-糖化酶(序列号I)的立体结构解析和功能预测，进一步使用与同源物的比对比较等方法，结果能够预期，上述第385位氨基酸、第491位氨基酸以及第535位氨基酸，对于酶的功能是重要的氨基酸。本发明的一个实施方式中，通过使与这些氨基酸相当的氨基酸发生突变对酶的结构进行修饰，改变α-葡萄糖苷酶的特性。此处的“特性”是糖转移活性和水解活性。本发明的修饰型酶中，糖转移活性和水解活性的平衡以修饰前为基准，向糖转移活性占主导的方向移动。典型地，作为修饰的结果，产生糖转移活性的提高或水解活性的降低或同时具有两种效果，获得能够高效糖转移的酶。
[0125]另一方面，将黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶的立体结构进行比较、将氨基酸序列进行比较等，结果表明，能够预期上述(4)?(14)所示的氨基酸是对结构修饰有效的氨基酸。本发明的另一方式中，通过使与这些氨基酸相当的氨基酸发生突变来修饰酶的结构，改变α-葡萄糖苷酶的特性。
[0126]此处，本说明书中关于氨基酸残基使用时的用语“相当”是指，比较的蛋白质(酶)之间对于其功能的发挥作出相同的贡献。例如，考虑到一级结构(氨基酸序列)的部分同源性并按照能进行最适合的比较的方式将比较对象的氨基酸序列相对于基准氨基酸序列(即序列号I的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列)进行排列时(此时，根据需要引入空位，可以优化比对)，可将与基准氨基酸序列中的特定的氨基酸对应的位置的氨基酸确定为“相当氨基酸”。通过代替一级结构彼此的比较或者在此基础上增加立体结构(三维结构)彼此的比较，也能够确定“相当氨基酸”。通过利用立体结构信息，能够得到可靠性高的比较结果。这种情况下，可采用一边比较多个酶的立体结构的原子坐标一边进行比对的方法。突变对象酶的立体结构信息，例如，可以通过(http://www.pdbj.0rg/index_j.html)的方式获得。
[0127]利用X-射线晶体结构分析进行的蛋白质立体结构的确定方法的一个例子如下所
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[0128](I)将蛋白质结晶化。结晶化对于立体结构的确定是必不可少的，除此以外，作为蛋白质的高纯度的精制方法、高密度稳定的保存方法在产业上也具有有用性。在这种情况下，可以将结合有作为配体的底物或者其类似化合物的蛋白质结晶化。
[0129](2)对制得的结晶进行X射线照射，收集衍射数据。应予说明，蛋白质晶体由于X射线照射而受到破坏、衍射能力劣化的情况多。在这种情况下，将结晶迅速冷却至约_173°C左右、在这种状态下收集衍射数据的低`温测量技术近来已经普及。应予说明，最终为了收集用于结构确定的高分辨率数据，采用高亮度的同步辐射。
[0130](3)进行晶体结构分析时，除了衍射数据以外，相位信息是必需的。对于目标蛋白质，在类似蛋白质的结晶构造未知的情况下，通过分子置换法确定结构是不可能的，必须通过重原子同晶置换法解决相位问题。重原子同晶置换法是一种在结晶中引入汞、钼等原子序号大的金属原子，利用金属原子大的X射线散射能力对X-射线衍射数据的贡献而获得相位信息的方法。确定的相位可通过使结晶中的溶剂区域的电子密度平滑化从而得到改善。由于溶剂区域的水分子波动大而导致几乎无法观察到电子密度，所以通过将该区域的电子密度近似为零，从而能够接近真正的电子密度，进而改善相位。另外，不对称单元中含有多个分子时，通过将这些分子的电子密度平均化从而相位进一步得到显著改善。在使用这样改善的相位计算得到的电子密度图中，拟合蛋白质的模型。该过程可在计算机图像中使用MSI公司(美国)的QUANTA等程序进行。然后，用MSI公司的X-PLOR等程序进行结构精密化，进而完成结构分析。对于目标蛋白质，在类似蛋白质的晶体结构已知的情况下，使用已知的蛋白质的原子坐标通过分子置换法来确定。分子置换和结构精密化可使用程序CNS_SOLVE ver.11 等进行。
[0131]本发明的突变对象酶的例子为人麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性α -葡萄糖苷酶C(Human Neutral alpha-glucosidase 0、鼠溶酶体<1-葡萄糖音酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的 α-葡萄糖音酶(Yeast GLU2A)、构巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 A(Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、构巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪卩圭毛霉的α -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α-葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、葱状被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierellaalliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的 α -葡萄糖音酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 α -葡萄糖音酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α-葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 α-葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 α -葡萄糖音酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的α-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)、马铃薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase) □登录在公共的数据库的这些α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列如下所示。
[0132]人麦芽糖酶-糖化酶(HumanMaltase-glucoamylase):序列号 I
[0133]黑曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase):序列号 2
[0134]人中性α -葡萄糖苷酶 C (Human Neutral alpha-glucosidase C):序列号 3
[0135]鼠溶酶体ct -葡萄糖音酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase):序列号 4
[0136]酵母的α -葡萄糖苷酶(Yeast GLU2A):序列号5
[0137]构巢曲霉的α -葡萄糖苷酶 A(Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA):序列号6
[0138]构巢曲霉的α -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB):序列号7
[0139]爪卩圭毛霉的α -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase):序列号 8
[0140]米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase):序列号 9
[0141]葱状被抱霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase):序列号10
[0142]粟酒裂殖酵母的α -葡萄糖音酶(Schizosaccharomyces pombealpha-glucosidase):序列号 11
[0143]德巴利酵母的α -葡萄糖音酶(Debaryomyces occidentalisalpha-glucosidase):序列号 12
[0144]大麦的α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase):序列号13
[0145]拟南芥的α-葡萄糖苷酶(Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase):序列号14
[0146]疲菜的ct -葡萄糖音酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase):序列号 15
[0147]舌甘菜的α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase):序列号 16
[0148]马铃薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase):序列号 17
[0149]此处，将具有序列号2的氨基酸序列的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶作为突变对象酶时，上述⑴的氨基酸为序列号2的第343位氨基酸；上述⑵的氨基酸为序列号2的第452位氨基酸；上述(3)的氨基酸为序列号2的第496位氨基酸；上述(4)的氨基酸为序列号2的第410位氨基酸；上述(5)的氨基酸为序列号2的第495位氨基酸；上述(6)的氨基酸为序列号2的第498位氨基酸；上述(7)的氨基酸为序列号2的第499位氨基酸；上述(8)的氨基酸为序列号2的第531位氨基酸；上述(9)的氨基酸为序列号2的第533位氨基酸；上述(10)的氨基酸为序列号2的第579位氨基酸；上述(11)的氨基酸为序列号2的第585位氨基酸；上述(12)的氨基酸为序列号2的第662位氨基酸；上述(13)的氨基酸为序列号2的第715位氨基酸；上述(14)的氨基酸为序列号2的第721位氨基酸。
[0150]取代后的氨基酸的种类没有特别的限制。因此，它可以是保守性氨基酸取代，也可以是非保守性氨基酸取代。此处，“保守性氨基酸取代”是指将某些氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基通过其侧链分为以下几个家族，碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。典型的保守性氨基酸替换可以是在同一家族内的氨基酸残基之间进行替换。
[0151]作为将具有序列号2的氨基酸序列的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶作为突变对相酶时的取代后的氨基酸的例子，可例举为对于(I)的氨基酸为半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或异亮氨酸；对于(2)的氨基酸·为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丙氨酸；对于(3)的氨基酸为缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、异亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或苏氨酸；对于(5)的氨基酸为甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸；对于出)的氨基酸是亮氨酸或丝氨酸。
[0152]上述(I)?(14)的氨基酸中，可以有两个以上的氨基酸被取代。作为被取代的氨基酸的组合，可以例示为⑴和⑵的组合以及⑴和⑶的组合。这些组合相当于后述实施例中得到的结构修饰酶。
[0153]此处，将修饰型酶的氨基酸序列的例子示于序列号18?42、74?78。这些序列是通过对黑曲霉的α-葡萄糖苷酶实施I个氨基酸取代(对(I)?(3)、(5)和(6)中任一个氨基酸)、实施2个氨基酸取代(对(I)和(2)的氨基酸、对(I)和(3)的氨基酸或对
(2)和(3)的氨基酸)或实施3个氨基酸取代(对⑴和⑵和(3)的氨基酸)而得到的修饰型酶的氨基酸序列。序列号和氨基酸取代的对应关系如下所示。应予说明，黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)中，第343位的色氨酸(W343)相当于(I)的氨基酸，第452位的缬氨酸(V452)相当于(2)的氨基酸，第496位的丝氨酸(S496)相当于(3)的氨基酸，第410位的异亮氨酸(1410)相当于(4)的氨基酸，第499位的缬氨酸(V499)相当于(7)的氨基酸，第531位的谷氨酸(Ε531)相当于(8)的氨基酸，第533位的苯丙氨酸(F533)相当于(9)的氨基酸，第579位的组氨酸(Η579)相当于(10)的氨基酸，第585位的天冬酰胺(Ν585)相当于(11)的氨基酸，第662位的酪氨酸(Υ662)相当于(12)的氨基酸，第715位的酪氨酸(Υ715)相当于(13)的氨基酸，第721位的亮氨酸(L721)相当于(14)的氨基酸。另外，构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶B的氨基酸序列(序列号7)中，第296位的酪氨酸(Υ296)相当于(I)的氨基酸，第456位的天冬酰胺(Ν456)相当于(3)的氨基酸，第363位的蛋氨酸(M363)相当于(4)的氨基酸，第455位的丙氨酸(A455)相当于(5)的氨基酸，第458位的酪氨酸(Y458)相当于(6)的氨基酸，第459位的天冬酰胺(N459)相当于(7)的氨基酸，第488位的天冬氨酸(D488)相当于(8)的氨基酸，第490位的亮氨酸(L490)相当于(9)的氨基酸，第565位的精氨酸(R565)相当于(10)的氨基酸，第571位的谷氨酰胺(Q571)相当于(11)的氨基酸，第646位的异亮氨酸(1646)相当于(12)的氨基酸，第700位的苯丙氨酸(F700)相当于(13)的氨基酸，第706位的异亮氨酸(1706)相当于(14)的氨基酸。
[0154]氨基酸序列:氨基酸取代
[0155]A.序列号 18:W343C
[0156]B.序列号 19:W343D
[0157]C.序列号 20:W343M
[0158]D.序列号 21:W343H
[0159]Ε.序列号 22:W343A
[0160]F.序列号 23:W343F
[0161]G.序列号 24:W343G
[0162]H.序列号 25:W343T
[0163]1.序列号 26:W343E.[0164]J.序列号 27:W343V
[0165]K.序列号 28:W343Q
[0166]L 序列号 29:W343N
[0167]Μ.序列号 30:W343I
[0168]N.序列号 31:V452G
[0169]0.序列号 32:V452D
[0170]P.序列号 33:V452E
[0171]Q.序列号:34:S496V
[0172]R.序列号 35:S496N
[0173]S.序列号 36:S496Q
[0174]T.序列号 37: W343D 和 V452A
[0175]U.序列号 38: W343D 和 V452G
[0176]V.序列号 39:W343D 和 S496I
[0177]W.序列号 40: W343D 和 S496R
[0178]X.序列号 41:W343M 和 S496C
[0179]Y.序列号 42: W343M 和 S496T
[0180]a.序列号 74:S495G
[0181]b.序列号 75:S495P
[0182]c.序列号 76:S495V
[0183]d.序列号 77:C498L
[0184]e.序列号 78:C498S
[0185]如果根据后述实施例(氨基酸取代的效果的确认)所示的实验结果，特别是在糖转移活性这点上，A?C、0、Q?S的修饰型α-葡萄糖苷酶的有用性高。另外，在水解活性非常低这点上，V和W的有用性高。另一方面，在对α-1，6键的降解活性非常低这点上，U、X和Y的有用性高。在糖转移活性优异这点上，Y的有用性也高。另外，a?c以显示al，6位特异性转移活性为特征。d和e的α -1, 4位特异性转移活性优异。
[0186]另外，通常，某些蛋白质的氨基酸序列一部分发生突变的情况下，突变后的蛋白质与突变前的蛋白质有时具有同等的功能。即氨基酸序列的突变对于蛋白质的功能没有产生实质的影响，突变前后蛋白质的功能得以保持。考虑到该技术常识，与由选自上述(I)?
(14)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列构成的修饰型酶进行比较时，尽管氨基酸序列略有差异(其中，氨基酸序列的区别是在进行上述的氨基酸取代的位置以外的位置产生)但在特性方面并没有观察到实质性差异的酶，可以看做与上述修饰型酶实质相同的酶。此处，“氨基酸序列略有差异”典型地是指，通过构成氨基酸序列的I个?多个(其上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸缺失、取代或者I个?多个(其上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的添加、插入或者是它们的组合，从而在氨基酸序列中产生突变(变化)。“实质相同的酶”的氨基酸序列与作为基准的上述修饰型酶的氨基酸序列的同源性(％)，例如为90%以上，优选为95%以上，更优选为98%以上，最优选为99%以上。应予说明，氨基酸序列的差异可以在多个位置上发生。“氨基酸序列略有差异”优选由保守型氨基酸取代而产生。
[0187](编码修饰型α-葡萄糖苷酶的核酸等) [0188]本发明的第二方面提供了与本发明的修饰酶相关的核酸。即，提供了编码修饰型酶的基因、可作为用于确定编码修饰型酶的核酸的探针使用的核酸、可作为用于使编码修饰型酶的核酸进行扩增或突然突变的弓I物使用的核酸。
[0189]编码修饰酶的基因典型地用于修饰型酶的制备。通过使用了编码修饰酶的基因的基因工程学制备方法，能够获得更均匀状态的修饰型酶。另外，该方法对于制备大量修饰型酶的情况也是一种合适的方法。应予说明，编码修饰型酶的基因的用途不限于修饰型酶的制备。例如，作为以阐明修饰型酶的作用机理为目的的实验用工具，或者作为用于设计或制备酶的进一步的修饰体的工具，可以利用该核酸。
[0190]本说明书中“编码修饰型酶的基因”是指将其表达时得到该修饰型酶的核酸，具有与该修饰型酶的氨基酸序列对应的碱基序列的核酸当然包含在内，另外也包含在这样的核酸中增加不编码氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，也可考虑密码子的简并。
[0191]将编码修饰型酶的基因的序列(碱基序列)的例子示于序列号43?67和79?83。这些序列为编码在黑曲霉的α-葡萄糖苷酶中进行特定的氨基酸取代而得的修饰型酶的基因。序列号和氨基酸取代的对应关系如下所示。
[0192]碱基序列:氨基酸取代
[0193]Α.序列号 43:W343C
[0194]B.序列号 44:W343D
[0195]C.序列号 45:W343M
[0196]D.序列号 46:W343H
[0197]Ε.序列号 47:W343A
[0198]R 序列号 48:W343F[0199]G.序列号 49:W343G
[0200]H.序列号 50:W343T
[0201]1.序列号 51:W343E
[0202]J.序列号 52:W343V
[0203]K.序列号 53:W343Q
[0204]L 序列号 54:W343N
[0205]Μ.序列号 55:W343I
[0206]N.序列号 56:V452G
[0207]0.序列号 57:V452D
[0208]P.序列号 58:V452E
[0209]Q.序列号 59:S496V
[0210]R.序列号 60:S496N
[0211]S.序列号 61:S496Q
[0212]T.序列号 62: W343D 和 V452A
[0213]U.序列号 63: W3 43D 和 V452G
[0214]V.序列号 64:W343D 和 S496I
[0215]W.序列号 65: W343D 和 S496R
[0216]X.序列号 66: W343M 和 S496C
[0217]Y.序列号 67: W343M 和 S496T
[0218]a.序列号 79:S495G
[0219]b.序列号 80:S495P
[0220]c.序列号 81:S495V
[0221]d.序列号 82:C498L
[0222]e.序列号 83:C498S
[0223]本发明的核酸可通过参考本说明书或附加的序列表公开的序列信息并使用标准的基因工程技术、分子生物学技术、生物化学技术等而制备成纯化的状态。
[0224]本发明的其它方式提供与编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列比较时，虽然其编码的蛋白质的功能相同，但是部分碱基序列不同的核酸(以下也称为“相同核酸”，另夕卜，将规定相同核酸的碱基序列称为“相同碱基序列”)。作为相同核酸的例子，可以例举为以编码本发明的修饰型酶的核酸的碱基序列为基准由含有I个或多个碱基的替换、缺失、插入、添加或倒置的碱基序列构成，编码具有修饰型酶中特征性的酶活性(即糖转移活性)的蛋白质的DNA。碱基的替换和缺失等可以发生在多个位点。此处的“多个”是指，根据该核酸编码的蛋白质的立体结构中氨基酸残基的位置、种类的不同而不同，例如，可以为2?40个碱基，优选为2?20个碱基，更优选为2?10个碱基。
[0225]上述相同核酸，例如，通过限制性内切酶处理、利用核酸外切酶或DNA连接酶等进行的处理、利用指定位置突然突变引入法(Molecular Cloning, ThirdEdition, Chapterl3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或随机突然突变引入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapterl3, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)进行的突变引入等而得到。另外，通过紫外线照射等等其它的方法，也能够获得相同核酸。
[0226]本发明的其它形式涉及具有与编码修饰型酶的基因的碱基序列互补的碱基序列的核酸。本发明的进一步的其它形式提供了相对于编码本发明的修饰型酶的基因的碱基序列或与之互补的碱基序列具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同源性的碱基序列的核酸。
[0227]本发明的进一步的其它形式涉及具有对与编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列或其相同碱基序列互补的碱基序列、在严格的条件下进性杂交的碱基序列的核酸。此处，“严格的条件”是指形成所谓特异性杂交而未形成非特异性杂交的条件。这种严格的条件是本领域技术人员公知的，例如，可以参考Molecular Cloning (Third Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York)或 Current protocols in molecularbiology (edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)进行设定。作为严格的条件，可以例举为使用杂交液(50%甲酰胺，10XSSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate，pH值
7.0)，5XDenhardt溶液，I % SDS, 10%葡聚糖硫酸酯，10 μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA，50mM的磷酸缓冲液(PH7.5))，在约42°C?约50°C进行孵育，然后使用0.1XSSC、0.1% SDS，在约65°C?约70°C进行清洗的条件。作为进一步优选的严格条件，可以例举为，使用50%甲酰胺，5 XSSC (0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 值 7.0)、I XDenhardt 溶液、I % SDS、10%葡聚糖硫酸酯、10 μ g/ml的变性鲑鱼精子DNA、50mM的磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。
[0228]本发明的进一步的其它形式是提供具有编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列或与其互补的碱基序列的一部分的核酸(核酸片段)。这样的核酸片段可用于具有编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列的核酸等的检测、确定和/或扩增等。核酸片段可以按照例如至少含有与编码本发明修饰型酶的基因的碱基序列中连续的核苷酸部分(例如，约10?约100个碱基长度，优选为约`20?约100个碱基长度，更优选为约30?约100个碱基长度)杂交的部分的方式来进行设计。作为探针使用时，可以将核酸片段进行标记化。标记化例如可以使用荧光物质、酶、酶放射性同位素。
[0229]本发明的再一方面涉及含有本发明基因(编码修饰型酶的基因)的重组DNA。本发明的重组DNA，例如以载体的形式提供。本说明书中术语“载体”是指能够将被插入到其中的核酸运输到细胞等的靶标内的核酸性分子。
[0230]根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，以及考虑宿主细胞的种类，可选择出适当的载体。作为以大肠杆菌为宿主的载体可以例举为M13噬菌体或其变体、λ噬菌体或其变体、PBR322或其变体(pB325、pAT153、pUC8等)等，作为以酵母为宿主的载体，例示为pYepSecUpMFa, pYES2等，作为以昆虫细胞为宿主的载体，可例示为pAc、pVL等，作为以哺乳类细胞为宿主的载体，可例示为pCDM8、pMT2PC等。
[0231]本发明的载体优选为表达载体。“表达载体”是指，能够将被插入到其中的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内且在该细胞内能够使其表达的载体。表达载体通常含有对被插入的核酸的表达所必须的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用含有选择性标记的表达载体。使用该表达载体时，能够利用选择性标记确认表达载体导入的有无(及其程度)。
[0232]本发明的核酸向载体的插入、选择性标记基因的插入(必要时)、启动子的插入(必要时)等，可以使用标准的重组DNA技术(例如，可参考Molecular Cloning, ThirdEdition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,使用限制性内切酶和DNA连接酶的公知方法)进行。
[0233]作为宿主细胞，从处理容易性的角度出发，优选使用大肠杆菌(Escherichiacoli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物。但是只要是重组DNA能够复制且修饰型酶的基因能够表达的宿主细胞就可以使用。作为大肠杆菌的例子，在使用T7系启动子的情况下，可例举为大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS，在并非如此的情况下，可例举出大肠杆菌JMl09。另外，作为出芽酵母的例子，可例举出出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22或出芽酵母INVScl (Invitrogen 公司)。
[0234]本发明的其它方面涉及具有本发明的重组DNA的微生物(即转化体)。本发明的微生物，可通过使用上述本发明的载体进行转染或转化而得到。例如，可通过氯化隹丐法(Journal of Molecular Biology (J.Mol.Biol.),第 53 卷，第 159 页(1970))、Hanahan 法(Journal of Molecular Biology,第 1册卷，第 557 页(1983))、SEM 法(Gene,第 96 卷，第 23 页(1990))、Chung 等的方法(Proc Natl Acad Sci U S A.,第 86 卷，第 2172 页(1989))、憐酸I丐共沉淀法、电穿孔(Potter, H.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，7161-7165 (1984))、脂质转染(Feigner, P.L.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84，7413-7417 (1984))等实施。应予说明，本发明的微生物可用于生产本发明的修饰型酶(参照后述的修饰型α-葡萄糖苷酶的制备方法一栏)。
[0235](含有修饰型α-葡萄糖苷酶的酶制剂)
[0236]本发明的修饰型酶，例如可以以酶制剂的形式提供。酶制剂，除有效成分(本发明的修饰型酶)以外，还可含有赋形剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋形剂，可使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、蔗糖、甘油等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作为防腐剂，可以使用 乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
[0237](修饰型α-葡萄糖苷酶的用途)
[0238]本发明的再一方面涉及修饰型酶的用途。作为该用途之一，提供低聚糖的制造方法。本发明的低聚糖的制造方法的第I方式中，为了利用对α-1，4键的特异性高的本发明的修饰型酶的特征，使用具有α-1，4键的二糖以上的低聚糖或多糖作为底物，使本发明的修饰型酶对该底物进行作用。该方式中，可以使用后述实施例所示的修饰型酶W343M、W343M/S496T、C498L、C498S等对α -1, 4键特异性高的酶。底物的例子为麦芽糖、麦芽三糖、潘糖、普鲁兰多糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、糊精、淀粉(马铃薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉等)等。也可以将两种以上的低聚糖或多糖的混合物作为底物。利用本发明的制造方法，能够特异性且高效地制造支链少的低聚糖。反应条件可以基于在使用α-葡萄糖苷酶制造低聚糖时通常采取的条件。
[0239]本发明的低聚糖的制造方法的第2方式中，使用显示α-1，6键特异性的糖转移活性的修饰型酶(例如，后述实施例所示的S495G、S495P、S495V)。此时底物的例子为异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖、异潘糖、淀粉(马铃薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉等)。通过该方式，典型地能够特异性且高效地制造支链多的低聚糖。[0240]为了提高目标低聚糖(第I方式中支链少的低聚糖，第2方式中典型的支链多的低聚糖)的产量，在修饰型酶之外还使用野生型酶。只要适于目标低聚糖的生产即可，野生型酶无特别限制。例如，可以采用与使用的修饰型酶相对应的野生型酶(即，为了得到该修饰型酶而进行修饰的酶)。与该例子对照地，也可以将来源不同的修饰型酶与野生型酶并用。作为一个示例，可以是将黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的修饰酶(修饰型酶)与构巢曲霉的野生型α-葡萄糖苷酶B并用。
[0241]此处，如后述实施例所示，将显示α -1, 6键特异性的糖转移活性的修饰型酶与野生型酶并用时可知，能够由具有α-1，4键的底物生成低聚糖。因此，本发明进一步的方式中，使显示α-1，6键特异性的糖转移活性的修饰型酶(例如，后述实施例所示的S495G、S495P, S495V)和野生型酶、与具有α-1，4键的底物进行作用，从而制得低聚糖。
[0242]对于本发明的修饰型酶，可期待通过其糖转移活性而实现防止淀粉老化的效果、改善食品风味的效果、调节肠功能效果等。因此，作为本发明的修饰型酶的用途的例子，可以举出防止食品中淀粉老化、食品风味的改善、调节肠功能等。考虑到用于这些用途，作为本发明的又一方面，提供含有修饰型酶的组合物(医药组合物、准医药组合物、化妆品组合物、食品组合物或饵料组合物)。
[0243]本发明的医药组合物和准医药组合物的制剂化可以根据常规方法进行。在制剂化时，可以含有制剂上可接受的其它成分(例如，载体、赋形剂、崩解齐U、缓冲齐U、乳化齐U、悬浮齐U、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋形剂可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、蔗糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、精氨酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为无痛化剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇，抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。
.[0244]制剂化时的剂型也无特别限制，例如可以以片剂、散剂、微粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂、外用剂以及栓剂等提供本发明的医药组合物或准医药组合物。
[0245]本发明的医药组合物中含有对达到期待的治疗效果或预防效果所必需的量(即，治疗有效量)的有效成分(修饰型酶)。同样，本发明的准医药组合物中含有对达到期待的治疗效果或预防效果所必需的量的有效成分。本发明的医药组合物或准医药组合物中含有的有效成分量通常随剂型?形态不同而不同，但是为了达到期望的给药量，将有效成分量设定在例如约0.1重量％?约95重量％的范围内。
[0246]本发明的医药组合物和准医药组合物根据其剂型.形态以口服或非口服(静脉内、动脉内、皮下、肌内、或腹腔注射、经皮、经鼻、经粘膜、涂布等)的方式适用于对象。此处的“对象”无特别限制，其包括人和人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、羊、狗、猫、鸡、鹌鹑等)。优选的一个实施方式中，适用对象是人。
[0247]本发明的医药组合物和准医药组合物的给药量.用量，可以根据得到期待的效果进行设定。在有效的给药量的设定中，通常要考虑适用对象的症状、年龄、性别、体重等。应予说明，本领域技术人员能够考虑到这些事项而设定出适当的给药量。作为给药方案，可以采用例如I日I次?数次、2日I次或3日I次等。制定给药方案的过程中，需要考虑适用对象的症状、有效成分的效果持续时间等。
[0248]本发明的化妆品组合物通过将修饰型酶和化妆品中通常使用的成分.基质(例如,各种油脂、矿物油、凡士林、角鲨烷、羊毛脂、蜂蜡、改性醇、棕榈酸糊精、甘油、甘油脂肪酸酯、乙二醇、对羟基苯甲酸酯、樟脑、薄荷醇、多种维生素、氧化锌、氧化钛、苯甲酸、乙二胺四乙酸、洋甘菊油、卡拉胶、几丁质粉末、壳聚糖、香料、着色剂等)配合而制得。作为化妆品组合物的形式，可例示为面部或身体用乳液、化妆水、霜、洗液、精华液、油、面膜、片、清洁剂等。化妆品组合物中修饰型酶的添加量无特别限制。例如，可以以0.01重量％?10重量％添加修饰型酶。
[0249]另一方面，作为本发明的“食品组合物”的例子，可例举出普通食品(米饭类、面包类、谷物、蔬菜、肉类、各种加工食品、点心类、牛奶、清凉饮料、酒精饮料等)、营养补充食品(补充剂、营养饮料等)、食品添加剂。对于营养补充食品或食品添加剂的情形，可以以粉末、颗粒末、片、膏、液体等形式提供。
[0250]本发明的“饵料组合物”的例子为宠物食品(狗、猫、鸟、鱼、爬行动物、两栖动物、
啮齿动物等的饵料)、饲料(家畜、家禽、观赏鱼等的饵料)。
[0251](修饰型α-葡萄糖苷酶的设计方法)
[0252]本发明的另一个方面涉及修饰型酶的设计方法，本发明的设计方法中实施以下步骤(i )和(? )，
[0253]步骤(i):在作为突变对象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，确定选自下述(I)?(14)中的一种或两种以上的氨基酸。
[0254](I)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸；
[0255](2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸；
[0256](3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸；
[0257](4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸；
[0258](5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸；
[0259](6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸；
[0260](7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸；
[0261](8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸；
[0262](9)与序列号I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸；
[0263](10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸；
[0264](11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸；
[0265](12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸；
[0266](13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸；
[0267](14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸；
[0268]取代对象氨基酸⑴?(14)是作为对酶的特性重要的氨基酸而确定的氨基酸。因此，如果取代这些氨基酸，则能够大大期待α-葡萄糖苷酶的特性发生变化。特别期待变化的特性是糖转移活性和水解活性。本发明的设计方法作为设计这两个活性的平衡发生改变的酶的方法特别有用。例如，在降低水解活性或使其消失的同时提高糖转移活性的目的下，可以利用本发明的设计方法。[0269]本发明的设计方法中的突变对象酶为α-葡萄糖苷酶。突变对象酶典型地为野生型酶(自然中发现的酶)。但是，这并不妨碍将已实施任何的突变或修饰的酶作为突变对象酶。突变对象酶的例子为人麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase) >黑曲霉的 α_ 葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性 α-葡萄糖苷酶 C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶体 α-葡萄糖苷酶(MouseLysosomal alpha-glucosidase)、酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、构巢曲霉的 α_ 葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、构巢曲霉的 α _ 葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪睡毛霉的ct -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α-葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、葱状被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierellaalliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 ct -葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 ct -葡萄糖昔酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的ct-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)、马铃薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。如上所述,这些α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列在公共的数据库中有收载(序列号I?17)。优选的一个实施方式中，将由它们中任意一个氨基酸序列构成的酶作为突变对象酶。
[0270]本发明中步骤(i)之后，进行以下的步骤(ii)。
[0271]步骤(ii):在 突变对象酶的氨基酸序列的基础上，构建将步骤(i)中确定的氨基酸序列取代为其它氨基酸而得的氨基酸序列。
[0272]取代后的氨基酸的种类无特别限制。因此，其可以为保守性氨基酸取代，也可以为非保守性氨基酸取代。
[0273](修饰型α-葡萄糖苷酶的制备方法)
[0274]本发明的又一个方面涉及修饰型酶的制备方法。本发明的制备方法的一个实施方式中，本发明人等应用基因工程方法制备修饰型酶取得成功。该实施方式的情况下，准备编码序列号18?42、74?78中任意一个氨基酸序列的核酸(步骤(I ))。此处，“编码特定的氨基酸序列的核酸”是在将其表达时得到具有该氨基酸序列的多肽的核酸，由与该氨基酸序列相对应的碱基序列构成的核酸当然可以，也可以在这样的核酸中增加多余的序列(可以是编码氨基酸序列的序列，也可以是不编码氨基酸序列的序列)。另外，也可以考虑密码子的简并。“编码序列号18?42、74?78中任意一个氨基酸序列的核酸”可以通过参考本说明书或附加的序列表公开的序列信息，使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生物化学方法等而制备成纯化的状态。此处，序列号18?42、74?78的氨基酸序列均是对源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列实施突变而得的氨基酸序列。因此，通过对编码源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的基因(序列号73)进行必要的突变，也能够得到编码序列号18?42、74?78中任意一个氨基酸序列的核酸(基因)。用于位置特异性碱基序列取代的方法在该【技术领域】中已知道很多(例如,可参考Molecular Cloning, ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),可以从中选择出的适当的方法使用。作为位置特异性突变导入法，可以采用位置特异性氨基酸饱和突变法。位置特异性氨基酸饱和突变法是以蛋白质的立体结构为基础，推定与所需功能相关的位置，导入氨基酸饱和突变的 “Sem1-rational, sem1-random” 方法(J.Mol.Biol.331，585-592 (2003))。例如，可以使用 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (东洋纺公司)、Quick change (Stratagene 公司)等试剂盒、Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res.16, 7351-7367 (1988))导入位置特异性氨基酸饱和突变。用于PCR的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。其中优选使用KOD-PLUS-(东洋纺公司)、Pfu turbo (Stratagene公司)等质量高的DNA聚合酶。
[0275]本发明的其它的实施方式中，以利用本发明的设计方法设计的氨基酸序列为基础，制备修饰型酶。该实施方式情况下，步骤(I )中，准备编码由本发明的设计方法构建的氨基酸序列的核酸。例如，以由本发明的设计方法构建的氨基酸序列为基础，对编码修饰型酶的基因进行必要的突变(即，作为表达产物的蛋白质中的特定位置上的氨基酸取代)，从而得到编码修饰型酶的核酸(基因)。
[0276]步骤(I )之后，将准备的核酸进行表达(步骤(II ))。例如，首先准备插入有上述核酸的表达载体，用其将宿主细胞进行转化。“表达载体”是指能够将插入其中的核酸导入目标细胞(宿主细胞)内，且在该细胞内能够表达的载体。表达载体通常含有对插入的核酸的表达所必需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用含有选择标记的表达载体。使用上述表达载体时，能够利用选择标记确认是否导入表达载体(及其程度)。
[0277]接下来，在作为表达产物的修饰型酶的产生的条件下，培养转化体。转化体的培养可以采用常规方法。作为培养基中使用的碳源，可以是能够同化的碳化合物，例如，可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、蜜糖、丙酮酸等。另外，作为氮源，可以是能够使用的氮化合物，例如，可使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆柏碱提取物等。以外，可根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素等。
[0278]另一方面，可以将培养温度设定在30°C?40°C的范围内(优选为37°C附近)。可考虑培养对象转化体的繁殖特性、修饰型酶的产生特性等对培养时间进行设定。培养基的pH在转化体繁殖且产生酶的范围内进行`调节。优选的培养基的pH在6.0?9.0左右(优选为ρΗ7.0附近)。
[0279]接下来，回收表达产物(修饰型酶)(步骤(III ))。培养后的含有菌体的培养液保持原状，或经过浓缩、去除杂质等之后，作为酶溶液进行利用，但是，通常从培养液或菌体中一度回收表达产物。表达产物为分泌型蛋白质时从培养液回收，除此以外的情况从菌体内回收。从培养液进行回收时，例如，过滤培养上清液、离心处理去除不溶物之后，通过将减压浓缩、膜浓缩、使用硫酸铵或硫酸钠进行盐析、通过甲醇、乙醇或丙酮等进行分别沉淀法、透析、加热处理、等电点处理、凝胶过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种色谱法(例如，通过葡聚糖(Sephadex)凝胶(GE Healthcare Science公司)等凝胶过滤,DEAE 琼脂糖 CL_6B(GE Healthcare Science 公司)、辛基琼脂糖 CL_6B(GE HealthcareScience公司)、CM琼脂糖CL-6B(GE Healthcare Science公司))等组合进行分离、纯化，得到修饰型酶的纯化品。另一方面，从菌体内回收时，通过过滤培养液、离心处理等收集菌体，然后，通过加压处理、超声波处理等机械方法或通过溶菌酶等酶方法将菌体破碎后，通过进行与前文相同的分离、纯化，能够制得修饰型酶的纯化品。[0280]可以通过例如冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等将如上得到的纯化酶以粉末化的形式进行提供。此时，可以将纯化酶预先溶解于磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris-HCl缓冲液或GOOD的缓冲液中。优选使用磷酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液。应予说明，此处，作为GOOD的缓冲液，可例举为PIPES、MES或MOPS。
[0281]通常如上所述利用合适的宿主-载体系统，进行基因的表达?表达产物(修饰型酶)的回收，但是也可以利用无细胞合成系统。此处，“无细胞合成系统(无细胞转录系统、无细胞转录/翻译系统)”是指不使用活细胞，而利用源自活细胞的(或者通过基因工程方法得到的)核糖体、转录.翻译因子等，由作为模板的核酸(DNA或mRNA)在体外合成其编码的mRNA、蛋白质。无细胞合成系统中，通常使用根据需要将细胞破碎液纯化得到的细胞提取液。细胞提取液中，通常含有蛋白质合成所必需的核糖体、起始因子等各种因子、tRNA等各种酶。进行蛋白质合成时，在该细胞提取液中，可添加各种氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白质合成必需的其它物质。当然，蛋白质合成时，也可以根据需要补充另外准备的核糖体或各种因子和/或各种酶等。
[0282]将蛋白质合成中必需的各分子(因子)重新构建的转录/翻译系统的开发也有报道(Shimizu, Y.et al.:Nature Biotech.，19，751-755，2001)。在该合成体系中，从大肠杆菌基因组将由构成细菌的蛋白质合成体系统的3种起始因子、3种延伸因子、与终止相关的4种因子、将各个氨基酸与tRNA连接的20种氨基酰基tRNA合成酶以及甲硫氨酰tRNA甲酰转移酶构成的31种因子的基因进行扩增，使用这些在体外重新构建蛋白质合成系统。本发明中也可以利用这种重新构建的合成系统。
[0283]术语“无细胞转录/翻译系统”可与无细胞蛋白质合成系统、体外翻译系统或体外转录/翻译系统交换使用。体外翻译系统中将RNA作为模板使用，合成蛋白质。作为模板RNA可以使用全RNA、mRNA、体外转录产物等。其它的体外转录/翻译系统中，使用DNA作为模板。模板DNA应含有核糖体结合区域，另外优选含有适当的终止子序列。应予说明，体外转录/翻译系统中，设定在 添加各反应所必需的因子以使得转录反应和翻译反应连续进行的条件。
[0284]实施例
[0285]A.修饰型α -葡萄糖苷酶的获得I
[0286]以α-葡萄糖苷酶(别名转葡萄糖苷酶。以下简称“TG”)为模型，利用蛋白质工程学，对将水解反应和脱水缩合反应一方向化的技术(One direction technology)进行研究。TG为在低聚糖制备中使用的酶，其具有水解糖苷键的活性，同时，也具有糖转移活性，能够由麦芽糖生成低聚糖类。为了开发出能够更有效率地进行糖转移的TG，进行了研究。
[0287](I)使用了计算机程序的突变导入点的研究
[0288]以在分子水平对TG进行结构修饰，设计出低聚糖生成能力提高的新型酶为目的，实施计算机模拟。关于X射线结晶结构解析已被报道的源自人小肠的α-葡萄糖苷酶(序列号I)，以基于TG的立体结构、进化的知识的功能预测为基础，通过计算机模拟确定突变导入点。具体而言，应用HotSpot Wizard程序(非专利文献Pavelka等Nucleic AcidsRes.37W376-83.(2009))，计算人α -葡萄糖苷酶中能够预想成为突变导入点的氨基酸，结果选出3个位点的氨基酸(第385位氨基酸:Υ385、第491位氨基酸:V491、第535位氨基酸:N535)。能够预见均在与底物相接的区域，与底物的活性相关(图1，A)。接下来，选择5种α -葡萄糖苷酶的同源物，应用CLUSTALW对上述突变导入点附近的序列进行比对比较。由于Y385、V491和N535均是附近的序列的同源性高地高度保守，所以可以预见它们是对酶的功能重要的区域。在黑曲霉(Asp.Niger)的TG中确定了与这些突变导入点对应的氨基酸(图1，C)。与Y385对应的氨基酸是W343，与V491对应的氨基酸是V452，与N535对应的氨基酸是S496。设计用于对这些氨基酸导入突变的引物，通过使用随机引物的反向PCR法进行突变导入。在大肠杆菌中进行转化，小量提取后进行序列分析，确认突变导入。
[0289](2)筛选系统的开发
[0290]将制备好的质粒转入酵母INVscI株进行培养。离心处理回收培养上清液，将分泌的酶作为结构修饰TG的样品。通过应用离心柱的超滤，对发酵液进行浓缩和脱盐，结果得到大约10?50倍浓缩的酶样品。
[0291]使用作为酶底物的麦芽糖,测定水解活性。将底物的终浓度配制为1%,利用含有葡萄糖氧化酶(GO)和过氧化物酶(PO)的氨基安替比林.苯酚的着色溶液将由水解生成的葡萄糖显色，测定0D500将其定量化。使用葡萄糖标准品制作标准曲线(Standard)，由吸光度计算出生成的葡萄糖量。
[0292]为了考察低聚糖合成活性，通过HPLC解析生成的低聚糖。使用50%麦芽糖水溶液作为底物，确定生成的低聚糖。HPLC的条件如下所示。
[0293]柱:TSKGELAmido-80 (TOSOH)
[0294]溶剂:MeCN/H20= 2/l
[0295]检测器:RI
[0296]将HPLC的区域面积制成图，由此推定分别生成的低聚糖的糖数。将上述的筛选方法的概述示于图2。
[0297](3) I个氨基酸取代的结构修饰TG的评价
[0298]黑曲霉的α-葡萄糖苷酶(序列号2)中，在与上述突变导入点(Y385、V491、Ν535)对应的位置、即W343、V452或S496，通过PCR法导入随机突变(I个氨基酸取代)。突变导入后，进行序列分析，确定导入的点突变。对得到的3种结构修饰TG(W343M、V452G、S496V)进行解析。应予说明，进行预实验，确认在培养上清液中发现源自质粒的蛋白质，且该酶具有水解活性。
[0299]首先，以高浓度麦芽糖溶液作为底物，测定低聚糖合成活性。作为其结果，在图3中示出了典型的HPLC图案。表达野生型(WT)TG的样品中，底物麦芽糖的峰减少，出现葡萄糖、异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖的峰(图3，A)。另外，在四糖的区域中发现两个分开的峰。
[0300]另一方面，与WT进行比较，在结构修饰的TG中，底物麦芽糖的峰减少，发现葡萄糖、麦芽三糖、潘糖的峰(图3，B?D)。另外，在四糖的区域中发现I个稳固的峰(图3，B?D)。结构修饰TG生成的低聚糖与WT不同，异麦芽糖类的低聚糖的生成量大幅降低。
[0301]接下来，通过将HPLC的区域进行定量，将结构修饰TG的低聚糖合成活性与WT进行比较。图4的图形示出了三糖以上的区域面积的总和。虽然WT也生成了三糖以上的低聚糖，但是在任何结构修饰TG中，生成的低聚糖的区域面积都比WT更大(大约增加20%)。
[0302]在考察取代后的氨基酸的种类与糖转移活性的关系的目的下，制备与突变导入点(385Y)对应的氨基酸W343相关的各种结构修饰TG，比较低聚糖合成能力。结果表明，取代后的氨基酸为半胱氨酸(W343C)、天冬氨酸(W343D)、蛋氨酸(W343M)、组氨酸(W343H)、丙氨酸(W343A)、苯丙氨酸(W343F)、甘氨酸(W343G)、苏氨酸(W343T)、谷氨酸(W343E)、缬氨酸(W343V)、谷氨酰胺(W343Q)、天冬酰胺(W343N)或异亮氨酸(W343I)时，结构修饰TG生成的三糖以上的低聚糖量与WT相比增加(图5，上图)。对四糖以上的低聚糖进行同样的比较，结果表明对于取代后的氨基酸为蛋氨酸(W343M)、天冬氨酸(W343D)、半胱氨酸(W343C)、苯丙氨酸(W343F)、谷氨酰胺(W343Q)、组氨酸(W343H)、苏氨酸(W343T)、谷氨酸(W343E)、甘氨酸(W343G)、天冬酰胺(W343N)、缬氨酸(W343V)或丙氨酸(W343A)，结构修饰TG比WT合成能力优异(图5，下图)。可以评价:三糖以上的低聚糖的合成量和四糖以上的低聚糖的合成量均较高的结构修饰TGJP W343C、W343D、W343M，低聚糖合成能力特别优异。另外，可以说四糖以上的低聚糖的合成量与WT相比明显多的W343M、W343D、W343C、W343F、W343Q和W343H对更长链的低聚糖的合成有利。
[0303]通过对HPLC的区域面积进行定量，将结构修饰TG的低聚糖合成活性与WT进行比较。制备与氨基酸V452相关的各种结构修饰TG，比较低聚糖合成能力。结果表明，取代后的氨基酸为甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸时，三糖以上的低聚糖量与WT相比增加(图6)。另夕卜，对四糖以上的低聚糖进行同样的比较，结果表明，取代后的氨基酸为天冬氨酸(V452D)时，结构修饰TG与WT相比，其合成能力优异(图6)。同样，制备与氨基酸S496相关的各种结构修饰TG，比较低聚糖合成能力。结果表明，取代后的氨基酸为缬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺时，对于三糖以上的低聚糖和四糖以上的低聚糖的任一情形，结构修饰TG均比WT合成能力优异(图6)。
[0304]根据上述内容，可知结构修饰TG中，异麦芽糖系低聚糖的生成量大幅降低。因此，考虑到对糖苷键的反应性发生变化，考察对各种糖苷键的水解活性。作为酶底物，制备作为二糖的麦芽糖U-l，4)、异麦芽糖(α-1，6)的水溶液。WT对α-1，4键和α-1，6键二者具有底物亲和性(图7)。对照地，尽管结构修饰TG对α -1, 4键的水解活性与WT型相比基本没有变化，但是对α -1, 6键的水解活性降低至1/5以下(图7)。
[0305](4) 2个氨基酸.取代的结构修饰TG的评价
[0306]取代第343位色氨酸的结构修饰TG中，通过导入进一步的突变(存在于隧道结构的表面的2个氨基酸(V452、S496)的任意一个)，制备对2个氨基酸导入突变的结构修饰TG0对得到的结构修饰TG的水解活性进行测定。如图8所示，在W343D/S496I (第343位W由D取代且第496位S由I取代)、W343D/S496R(第343位W由D取代且第496位S由R取代)完全未检测出活性。另一方面，W343D/V452G (第343位W由D取代且第452位V由G取代)、W343M/S496C (第343位W由M取代且第496位S由C取代)、W343M/S496T (第343位W由M取代且第496位S由T取代)的3种结构修饰TG，其异麦芽糖的水解活性大幅降低(约1/20)。
[0307]接下来，测定低聚糖合成活性。使WT型TG表达的样品中，关于三糖，发现了潘糖和异麦芽三糖的峰(图9，A)。另一方面，W343M中，与目前为止的结果同样，关于三糖，发现麦芽三糖和潘糖的峰(图9、B)。作为2个氨基酸取代TG的W343M/S496T和W343D/V452G中，关于三糖，仅发现I个峰，可以预见为麦芽三糖(图9、C和D的箭头)。另外，在四糖的区域中，通过HPLC仅发现了 I个峰，得到与WT型的分析图案有很大差别的结果(图9、C和D)。该四糖的峰是仅在2个氨基酸取代TG中看到的峰，表明生成的低聚糖与WT型不同。
[0308]通过对HPLC的区域面积进行定量，将结构修饰TG的低聚糖合成活性与WT进行比较。所有的2个氨基酸取代TG，生成的低聚糖的区域面积均比WT大，三糖以上的低聚糖的合成量增加20-50%(图10)。另外，W343M/S496T的四糖以上的低聚糖的合成量与WT相比显著增多，增加近70%(图10)。
[0309]另一方面，研究结构修饰TG对糖苷键的水解活性。W343M/S496T中，对麦芽糖和麦芽三糖的水解活性为50%，对异麦芽糖的水解活性为10%以下(图11)。对曲二糖的水解活性约为40%，对黑曲霉糖的水解活性降低至大约10%(图11)。由上述的结果可知，将2个氨基酸取代的结构修饰TG的水解活性降低，特别是对α -1, 6键和α -1, 3键的水解活性大幅降低。
[0310](5)结构修饰TG生成的低聚糖的解析
[0311]根据以往的报告，如果低聚糖合成时使用的起始底物的糖数增加，则TG生成的低聚糖中的α-1，6键的比例增加。因此，以五糖的麦芽五糖为底物进行低聚糖合成反应，在WT型与结构修饰TG之间比较生成的低聚糖。首先，测定作为标准的葡萄糖(G=I)、麦芽糖(G=2)、麦芽三糖(G=3)、麦芽五糖(G=5)确认峰的位置(图12)。WT型TG中，在葡萄糖?七糖以上的区域，大范围地进行分解和生产(图12)。但是，五糖以下的比例多，能够预见与低聚糖合成相比，水解占优。另一方面、结构修饰TG(W343M和W343M/S496T)中，水解到I糖、2糖的较少，六糖以上的生成量变多(图12)。图12的箭头显示的区域，在WT和结构修饰TG之间的差异特别大。
[0312]接下来，将麦芽糖和异麦芽糖的混合溶液作为起始底物，进行低聚糖合成。生成的低聚糖的比例没有大的变化，但是，生成的三糖的种类存在差别。WT型中具有2个α-1，6键的异麦芽三糖大量生成(图13)。另一方面，结构修饰TG(W343M和W343M/S496T)中，具有α_1，4键和α-1，6键的潘糖生成最多(图13，箭头)。另外，对于结构修饰TG的情形，起始底物的异麦芽糖基本没有被分解。
[0313]通过上述结果，启示了 `WT型TG主要生成在α-1，6位进行糖转移的低聚糖，与此相对，结构修饰TG特异性生成在α -1, 4位进行糖转移的低聚糖。
[0314]应予说明，在本次的研究中制成的各结构修饰TG的氨基酸序列如下所示。
[0315]序列号18:W343C
[0316]序列号19:W343D
[0317]序列号20:W343M
[0318]序列号21:W343H
[0319]序列号22:W343A
[0320]序列号23:W343F
[0321]序列号24:W343G
[0322]序列号25:W343T
[0323]序列号26:W343E
[0324]序列号27:W343V
[0325]序列号28:W343Q
[0326]序列号29:W343N
[0327]序列号30:W343I
[0328]序列号31:V452G[0329]序列号32:V452D
[0330]序列号33:V452E
[0331]序列号34:S496V
[0332]序列号35:S496N
[0333]序列号36:S496Q
[0334]序列号37: W343D/V452A
[0335]序列号38: W343D/V452G
[0336]序列号39:W343D/S496I
[0337]序列号40: W343D/S496R
[0338]序列号41:W343M/S496C
[0339]序列号42: W343M/S496T
[0340]B.修饰型α -葡萄糖苷酶的获得2
[0341 ] (I)使用了计算机模拟软件MOE的突变导入点的研究
[0342]以用新方法确定突变导入点为目的，使用作为计算机模拟软件的M0E(ChemicalComputing Group公司)研究TG的突变导入点。此时，将类似的属于麹菌的黑曲霉和构巢曲霉的序列进行比较，推定 突变导入点。
[0343]可以从公知的信息数据库获得黑曲霉的TG和构巢曲霉的TG(a-葡萄糖苷酶B)的氨基酸序列，将其录入Μ0Ε，在计算机上进行蛋白质建模。以各自氨基酸序列为基础，从MOE的数据库检索同源性高的序列。结果发现，均检索到了相同的序列，选择人TG。接下来，以该立体结构为模板，将各自的蛋白质进行建模。在力场“AMBER99”中，制出5个中间体模型，最后制成I个模型结构。
[0344]接下来，进行对接模拟解析，预测底物口袋。将力场设定为“MMFF99X”，在MOE的Site Finder中检索口袋。其结果能够预测多个可能成为立体结构的口袋的候选区域。因此，检索以往论文等报告的成为TG活性中心的氨基酸，确定各自在模型上的位置。然后，将作为活性中心的含有多个氨基酸的区域确定为由模拟计算而得的底物口袋。
[0345]成功建模的各个立体结构如图14所示。如果比较黑曲霉的TG和构巢曲霉的TG的结构，则尽管以相同的人TG的立体结构为基础建模，但各自的立体结构之间发现有很大差别。比较模拟出的底物口袋时，与黑曲霉相比构巢曲霉的底物口袋变小。黑曲霉中由30个氨基酸构成底物口袋，与此相对，构巢曲霉由22个氨基酸构成(图14)。
[0346]接下来，通过CLASTAL-W对黑曲霉的TG的氨基酸序列和构巢曲霉的TG的氨基酸序列进行比对。比较全部的氨基酸序列时，这两个蛋白质的同源性低，计算得出氨基酸相同的比例为35%。但是，仅限于对底物口袋的序列进行比较时，序列的同源性变高，黑曲霉的底物口袋的30个中19个氨基酸相同，构巢曲霉的22个中19个氨基酸相同(图15)。该结果提示与活性相关的氨基酸与全部序列相比是高度保守的。另一方面，判断不一致的氨基酸进化性保守性不高，可预期能够导入突变。因此，将这些氨基酸作为突变导入的候选点位(图15)。另外，由于选择了已经导入突变的W343和S496，所以认为与应用了目前为止使用的人TG的利用Hot spots wizard进行的模拟具有相关性。
[0347]实际操作中，为了对黑曲霉的TG进行突变导入而设计引物，并以应用了随机引物的反向PCR(inverse PCR)法进行突变导入。对大肠杆菌进行转化，小量提取(min1-prep)后，进行序列解析，确认突变导入。另外，对酵母进行转化，表达重组的结构修饰TG，进行解析。实际操作中，示出了对于S495和C498的这2点的解析结果。
[0348](2) S495修饰型TG的评价
[0349]黑曲霉的TG中，在第495位的丝氨酸(S495)通过PCR法导入随机突变(I个氨基酸取代)。进行序列解析，确定导入的点突变，对修饰型TG进行解析。
[0350]对于这些修饰型TG，使用HPLC测定低聚糖合成活性并进行比较。作为底物，使用50%麦芽糖水溶液、异麦芽糖水溶液以及作为五糖的低聚糖的麦芽五糖水溶液。将反应温度设定为50°C孵育一定时间(麦芽糖、麦芽五糖:48小时，异麦芽糖:96小时)。
[0351]通过对HPLC的区域面积进行定量，比较修饰型TG的低聚糖合成活性。对于底物为麦芽糖的情形，三糖以上和四糖以上的区域面积的总和，S495G比WT大。但是，S495P和S495T反而减少(图16)。
[0352]对于底物为异麦芽糖的情形，三糖以上的区域面积的总和，S495G、S495P和S495V比WT大(图17)。另外，四糖以上的区域面积的总和，S495G和S495P比WT大，提示低聚糖合成能力提高(图17)。观察HPLC的峰，三糖中异麦芽三糖增加，能够推测结构修饰TG与WT同样具有使糖向α-1,6转移的活性。由以上结果可知，S495G、S495P和S495V这3种能够使α 1，6键的低聚糖增加50%以上。
[0353]因此，考虑到结构修饰TG对糖苷键的反应性不同，研究了对各种糖苷键的水解活性(图18)。作为底物使用麦芽糖水溶液和异麦芽糖水溶液，通过对生成的葡萄糖量进行定量，来评价水解活性。结果 显示，WT对α -1, 4键和α -1, 6键这两种糖苷键具有底物亲和性。另一方面，S495A、S495G、S495P、S495T和S495V对麦芽糖的水解活性比WT低，但是，对异麦芽糖的水解活性相对升高。通过以上内容可知，取代S495的结构修饰TG对α -1，6键特异性提闻。
[0354]最后，以五糖的麦芽五糖为起始底物，进行低聚糖合成反应，在WT型TG和结构修饰TG之间比较生成的低聚糖(图19)。WT型TG中从葡萄糖到六糖以上的区域内大范围地发生分解和生产。绘制成图可以看出，一糖的量最多，可见反应中进行了水解。结构修饰TG中，均发现低聚糖的增加。特别地，S495P型和S495V型的结构修饰TG，被水解的糖类较少，六糖以上的生成变多(图19c)。
[0355]如上所述，成功获得3种具有α 1，6位特异性转移活性的结构修饰TG。另外，可知由结构修饰TG生成的低聚糖以含有α 1，6键的键合方式进行聚合，低聚糖的生成量增加。
[0356](3) C498修饰型TG的评价
[0357]在黑曲霉的TG中，在第498位的半胱氨酸(C498)通过PCR法导入随机突变(I个氨基酸取代)。进行序列解析，确定导入的点突变，对修饰型TG进行解析。
[0358]对于这些结构修饰TG，使用HPLC测定低聚糖合成活性并进行比较。使用60%麦芽糖水溶液作为底物，在反应温度50°C孵育48小时。
[0359]通过对HPLC的区域面积进行定量，比较结构修饰TG的低聚糖合成活性(图20)。比较三糖以上的区域面积的总和，结果与WT相比，C498L和C498S的区域面积增大。另外，四糖以上的区域面积的总和也同样地，与WT相比，C498L和C498S确认增大。
[0360]以目前的研究为出基础，考虑结构修饰TG对糖苷键的反应性产生变化，测定水解活性。使用麦芽糖水溶液和异麦芽糖水溶液作为底物，对生成的葡萄糖量进行定量。如图21所示，可知与WT相比，C498L和C498S对麦芽糖的水解活性高。另外，发现这些结构修饰TG中，麦芽糖水解活性和异麦芽糖水解活性的比例发生大幅变化,可知对α 1,4键的特异性提闻。
[0361]如上所述，C498中通过突变导入低聚糖合成上升。另外，成功获得2种低聚糖的合成能力提高的结构修饰TG (显示α 1，4位特异性转移活性)。
[0362]另外，本次研究中制备的各结构修饰TG的氨基酸序列如下所示。
[0363]序列号74:S495G
[0364]序列号75:S495P
[0365]序列号76:S495V
[0366]序列号77:C498L
[0367]序列号78:C498S
[0368]C.结构修饰TG在食品领域的应用
[0369]为了评价结构修饰TG在健康食品领域的应用可能性，使用人工消化模型系统进行实验。该模型系统中，使用源自唾液的淀粉酶将粥分解，考察TG对分解生成的低聚糖进行怎样的作用。对市售的粥，在接近胃液的PH的酸性范围内，使淀粉酶和TG作用(30分钟?2小时，37°C加热)，然后，采样并终止酶反应。然后，通过HPLC对生成的低聚糖进行分析。淀粉酶的添加量，设定为相当于唾液中淀粉酶的量1.45U/ml。另外，以事先的预研究的结果为基础，将TG量设定为20 μ g/mL。以下，对实验报告详细说明。
.[0370](实验报告)
[0371]⑴将粥(味之素株式会社)由搅拌机进行破碎，加入1/20量的IMNaOAc缓冲液(ρΗ5.0)。
[0372](ii)制备340 μ I的酶液(蛋白浓度:20 μ g/mL)。
[0373](iii)在玻璃试管中，加入⑴的粥0.65g、淀粉酶1.45U和酶液340 μ I。
[0374](iv)在37°C的热水浴中进行孵育，每30分钟，取样200 μ I置于微试管。
[0375](V)煮沸5分钟，终止酶反应。
[0376](vi) 12000rpm离心处理后，将上清液转移至新的试管中。
[0377](vii)取120 μ 1，使用MilliQ (注册商标)水稀释到3倍。
[0378](viii)按以下条件进行HPLC解析。
[0379](柱条件)
[0380]柱:TSKGELAmido-80
[0381]溶剂:MeCN/H20=2/l
[0382]检测器:RI
[0383]流速:Iml/分钟
[0384]对生成的低聚糖进行HPLC解析的结果如图22所示。通过淀粉酶的添加，全部的糖中40?50%变为麦芽糖(图22 (a))。另外，生成三糖的麦芽三糖和四糖的麦芽四糖。基本没有生成葡萄糖，二糖没有发生分解。添加野生型(WT) TG时，葡萄糖的生成量经时增加，反应开始60分钟后，发现生成异麦芽糖，伴随时间的延长三糖以上的低聚糖减少(图22(b)、(d))。添加作为α 1，4位特异性的结构修饰TG的W343M时，与野生型TG的情形同样地麦芽糖分解发生糖转移反应。反应开始30分钟后，与野生型TG之间，生成的低聚糖没有大的差异，观察到麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖的峰(图22(c))。在另一方面中，W343M能够抑制葡萄糖的生成，同时能够将麦芽糖转移成三糖以上的低聚糖(图22(c))。与野生型TG相对照，添加W343M的情形中，很少见到三糖以上的低聚糖的减少，最终生成的低聚糖的量特别多(图22 (d))。如果观察实际的HPLC图案(反应开始后90分钟后)，则在添加W343M的情形中，没有发现异麦芽糖的峰，而发现了尺寸更大的低聚糖的峰(图23)。
[0385]如上所述，使用作为结构修饰TG的W343M时，与使用野生型TG的情形相比，异麦芽糖的生成量减少，另一方面，麦芽三糖这类链长较长的α 1，4键的低聚糖的生成量增加。反应开始90分钟后进行比较时，结构修饰TG的葡萄糖生成量与野生型TG相比减少19.2%，三糖以上的低聚糖的生成量增加42.7%。这样，证明了在人工消化模型系统中也适于低聚糖的生成这样的结构修饰TG的有用性。
[0386]D.野生型(WT) TG与结构修饰TG的并用
[0387](I)以麦芽糖为底物的低聚糖合成
[0388]使用具有α 1，6位特异性转移活性的结构修饰TG，以作为α 1，4键的二糖的麦芽糖为底物，尝试进行低聚糖合成反应，结果没有发生低聚糖合成。其原因在于具有α 1，6位特异性转移活性的结构修饰TG对α 1，4键的反应性低，即使底物为麦芽糖也不能够充分推进低聚糖合成反应。因此，考虑如果与供给异麦芽糖的酶并用，则即使在以麦芽糖为底物的情形下也能够推进低聚糖合成反应，将具有将麦芽糖变换为异麦芽糖的酶活性的WT型TG和结构修饰TG(S495P)并用，进行低聚糖合成。通过HPLC对生成的低聚糖进行解析。应予说明，作为底物使用50%麦芽糖水溶液，在50°C反应48小时。
[0389]对于S495P单独的情形和混合WT型和S495P的情形(混合比例2:1、1:1或1:2)进行低聚糖合成，通过HPLC对生成的低聚糖进行解析。对于S495P单独的情形，虽然生成作为三糖的潘糖，但是四糖以上的低聚`糖生成非常少。S卩，未发生四糖以上的反应(图24的S495P、图25的S495P)。另一方面，将WT型与S495P并用的情形中，即使是以任意比例混合，三糖以上的低聚糖量与四糖以上的低聚糖量均出现增加(图24的WT:S495=2:1、WT:S495=1:1、WT:S495=1:2)。特别需要注意的是，S495P单独的情形时生成的低聚糖基本上都是潘糖，与此相对在WT型和S495P并用的情形中，发现潘糖和异麦芽三糖的产生(图25，通过箭头示出的峰)，进而，也发现四糖以上的低聚糖的生成。如上所述，WT型与具有α 1，6位特异性转移活性的结构修饰TG的并用有效，由具有α 1，6位特异性转移活性的结构修饰TG单独使用时未发生反应的α 1，4键的糖类也可以生成低聚糖。
[0390](2)结构修饰TG在食品领域的应用
[0391]对于具有α I, 6位特异性转移活性的结构修饰TG，使用人工消化模型系统进行实验。实验报告与上述C.的情形相同。
[0392]粥中仅添加淀粉酶时，生成的糖类40?50%为麦芽糖。另外，生成三糖的麦芽三糖和四糖的麦芽四糖。可认为它们都是al，4键的糖类，所以具有al，6位特异性转移活性的修饰型α-葡萄糖苷酶在单独使用时不发生反应。因此，与D的(I)同样地，将WT型TG与结构修饰TG(S495P)并用，尝试低聚糖合成。
[0393]首先，对于在粥中添加淀粉酶和WT型的情形，30分钟后反应进行，葡萄糖的生成量逐渐增加(图26(a))。另外，反应开始60分钟后生成异麦芽糖，三糖以上的低聚糖逐渐减少。另一方面，对于向粥中添加淀粉酶和S495P的情形，仅生成淀粉酶所致的糖类，即使在反应开始120分钟后，麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖基本保持原状(图26(b))。与此相对，将淀粉酶、WT型和S495P这3种酶并用的情形中(WT型与S495P的混合比例为1:2)，麦芽糖发生分解，糖转移反应进行。反应开始60分钟以后，与WT型单独的情况相比，三糖以上的低聚糖增加(图26(d))。将3种酶并用的情形中，发现麦芽糖的减少与三糖以上的低聚糖的比例增加(图26 (c))，认为进行了低聚糖合成。如果观察实际的HPLC图案，则发现并用3种酶时，由淀粉酶生成的麦芽糖和麦芽三糖的峰减少，另一方面，发现了潘糖、四糖的低聚糖的峰(图27右下图，箭头)。另外，与淀粉酶中仅并用WT型的情形(图27左下图)相t匕，可知三糖以上的低聚糖基本没有减少，三种酶(淀粉酶、WT型和S495P)的并用对于低聚糖的生成是有效的。
[0394]如上所述，在生成低聚糖这点上，将WT型与具有α I, 6位特异性转移活性的结构修饰TG并用，显示是非常有效果的。
[0395]产业上的可利用性
[0396]本发明的修饰型α-葡萄糖苷酶的糖转移活性高。利用该特性，可期待用于低聚糖的制造(合成)。另外，本发明的设计方法，作为提高野生型酶等的糖转移活性的手段是有用的，可用于各种α-葡萄糖苷酶的修饰。 [0397]本发明不受上述发明的实施方式以及实施例的说明任何限制。在不脱离要求保护的范围的记载、本领域技术术人员能容易想到的范围内进行的各种变形方式也包含在本发明的范围内。本说明书中给出的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容，通过援引而引用其全部内容。
【权利要求】
1.一种修饰型a -葡萄糖苷酶，其特征在于，由a-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中选自以下(I)?(14)中的一个或两个以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列构成: (1)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸； (2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸； (3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸； (4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸； (5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸； (6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸； (7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸； (8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸； (9)与序列号I所示的 氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸； (10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸； (11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸； (12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸； (13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸； (14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的修饰型a-葡萄糖苷酶，其中，a-葡萄糖苷酶为人麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性 ct-葡萄糖苷酶 C (HumanNeutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶体 α -葡萄糖苷酶(Mouse Lysosomalalpha-glucosidase)、酵母的α -葡萄糖苷酶(Yeast GLU2A)、构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、构巢曲霉的 α-葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪睡毛霉的 ct -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillusoryzae alpha-glucosidase)、葱状被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierella alliaceaalpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母菌的 ct -葡萄糖昔酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vu lgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 ct -葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 ct -葡萄糖昔酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的ct-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或马铃薯的α_葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
3.根据权利要求1所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为序列号2的氨基酸序列， (I)的氨基酸为该氨基酸序列第343位氨基酸；(2)的氨基酸为该氨基酸序列第452位氨基酸；(3)的氨基酸为该氨基酸序列第496位氨基酸；(4)的氨基酸为该氨基酸序列第410位氨基酸；(5)的氨基酸为该氨基酸序列第495位氨基酸；(6)的氨基酸为该氨基酸序列第498位氨基酸；(7)的氨基酸为该氨基酸序列第499位氨基酸；(8)的氨基酸为该氨基酸序列第531位氨基酸；(9)的氨基酸为该氨基酸序列第533位氨基酸；(12)的氨基酸为该氨基酸序列第662位氨基酸；(13)的氨基酸为该氨基酸序列第715位氨基酸；(14)的氨基酸为该氨基酸序列第721位氨基酸。
4.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸，取代后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或异亮氨酸。
5.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
6.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
7.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是对于(I)的氨基酸而言为天冬氨酸，对于(2)的氨基酸而言为丙氨酸或甘氨酸。
8.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是对于(I)的氨基酸而言为天冬氨酸或蛋氨酸，对于(3)的氨基酸而言为异亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或苏氨酸。
9.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(5)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、脯氨酸或缬氨酸。
10.根据权利要求3所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是￠)的氨基酸，取代后的氨基酸是亮.氨酸或丝氨酸。
11.根据权利要求1所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列号18?24以及77?78中的任意一个氨基酸序列构成。
12.根据权利要求1所述的修饰型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列号74?76中的任意一个氨基酸序列构成。
13.—种基因，其编码权利要求1?12中任一项所述的修饰型α -葡萄糖苷酶。
14.根据权利要求13所述的基因,含有序列号43?67以及79?83中的任意一个碱基序列。
15.一种重组DNA，含有权利要求13或14所述的基因。
16.—种微生物,具有权利要求15所述的重组DNA。
17.—种酶制剂，含有权利要求1?12中任一项所述的修饰型α -葡萄糖苷酶。
18.一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使权利要求1?8、10和11中的任一项所述的修饰型α-葡萄糖苷酶与具有α-1，4键的二糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
19.一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使权利要求9或12所述的修饰型α-葡萄糖苷酶与具有α-1，6键的二糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
20.根据权利要求18或19所述的低聚糖的制造方法，其特征在于，与野生型的酶并用。
21.一种低聚糖的制造方法，其特征在于，使权利要求9或12所述的修饰型α-葡萄糖苷酶和野生型的酶、与具有α -1, 4键的二糖以上的低聚糖或多糖进行作用。
22.—种医药组合物、准医药组合物、化妆品组合物、食品组合物或饵料组合物，含有权利要求I?12中任一项所述的修饰型α -葡萄糖苷酶或权利要求17所述的酶制剂。
23.—种修饰型α-葡萄糖苷酶的设计方法，其包含以下步骤(i )和(ii )，(i)在作为突变对象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，确定选自以下(I)?(14)中的一个或两个以上氨基酸的步骤: (1)与序列号I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相当的氨基酸； (2)与序列号I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相当的氨基酸； (3)与序列号I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相当的氨基酸； (4)与序列号I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相当的氨基酸； (5)与序列号I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相当的氨基酸； (6)与序列号I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相当的氨基酸； (7)与序列号I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相当的氨基酸； (8)与序列号I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相当的氨基酸； (9)与序列号I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相当的氨基酸； (10)与序列号2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相当的氨基酸； (11)与序列号2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相当的氨基酸； (12)与序列号I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相当的氨基酸； (13)与序列号I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相当的氨基酸； (14)与序列号I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相当的氨基酸； (?)以突变对象酶的氨基酸序列为基础，构建将步骤(i)中确定的氨基酸序列取代为其它氨基酸的氨基酸序列的步骤。
24.根据权利要求23所述的设计方法，其中，α-葡萄糖苷酶为人麦芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C(Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶体α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、构巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、构巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、葱状被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麦的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvu lgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、拟南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或马铃薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
25.根据权利要求23所述的设计方法，其中，α-葡萄糖苷酶含有序列号I?17中任一个氨基酸序列。
26.根据权利要求23所述的设计方法，其中，α-葡萄糖苷酶由序列号2的氨基酸序列构成，步骤(i )中被取代的氨基酸为选自(I)?(14)中的一个氨基酸、选自(I)?(14)中的两个氨基酸或选自(I)?(14)中的三个氨基酸。
27.一种修饰型α-葡萄糖苷酶的制备方法，含有以下步骤(I )?(III):(I )准备核酸的步骤，该核酸编码序列号18?42和74?78中的任意一个氨基酸序列或通过权利要求23?26中任一项所述的设计方法构建的氨基酸序列； (II )使所述核酸表达的步骤；以及 (III)回收表达产物的步骤。
28.一种α-葡萄糖苷酶，`其具有α_1，4位特异性或α _1，6位特异性转移活性。
【文档编号】C12P19/16GK103443273SQ201280013352
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年3月5日 优先权日:2011年3月16日
【发明者】石原聪 申请人:天野酶株式会社