专利名称：一种用于降解纤维素的混合酶的制作方法
技术领域：
本发明属于畜牧业饲料加工领域，具体涉及一种用于降解纤维素的混合酶。
背景技术：
纤维素酶是我国畜禽日粮中应用比较普遍的酶制剂种类之一，生产和销售纤维素酶的企业有很多，如何对众多的纤维素酶产品进行筛选，为不同品种、不同生长阶段的猪选择经济有效的纤维素酶，则显得十分必要。我国地方品种猪通过长期的选育与饲养，大多具有耐粗饲、适应性强等优点，并且在长期饲喂过 程中形成了使用纤维性饲料的习惯。随着对日粮纤维理化特性和营养生理作用研究的深入，人们发现一定水平的日粮纤维不仅能够调节胃肠道的微生态平衡，而且还能够增强猪的体质。因此，日粮纤维在猪的生理代谢上有着重要作用，特别是在地方品种猪上这种作用尤为明显。粗纤维虽然具有供能、调节肠道生态环境等正面营养作用，但也具有适口性差、影响养分吸收、环境污染等负面营养作用。因此，根据地方品种耐粗饲的特性，通过在高纤维水平日粮中添加能够降解纤维素的酶来克服其负面营养作用，利用其正面营养作用来提高地方品种猪的生产性能，同时解决饲料资源短缺及环境污染等问题就具有重要的意义。但目前用于猪饲料领域的纤维素酶酶系酶功能单一，不能充分满足实际生产的需要。随着生物工程技术以及基因克隆技术的发展，生产纤维素酶的菌株变得越来越多，产量也越来越大，这就使得纤维素酶的酶系越来越丰富。我们可以将不同菌株产生的纤维素酶进行配合来解决单一酶系酶功能不全的劣势，这样就使得我们可以更多地去选择高纤维含量的饲料原料，来缓解人畜争粮的矛盾。目前，市场上没有一种产品是将不同纤维素酶配合作用来实现纤维素酶的高效利用的。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于降解纤维素的混合酶，即将三种纤维素酶混合制成复合酶，以克服单一酶系功能不全的劣势。本发明的用于降解纤维素的混合酶，由纤维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶组成，且纤维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶的质量比为3 3 :2。为了增加混合酶降解纤维素的效果，在混合酶中加入了双歧杆菌活菌，加入的双歧杆菌活菌的浓度为I 5Χ 107_9CFU/g。本发明的混合酶作为添加剂应用在猪饲料的制备中。本发明的复合纤维素酶克服了单一酶系功能不全的劣势，能够提高动物生产的生长性能、养分消化率和动物利用纤维素的能力，起到了一举多得作用。复合纤维素酶所需的三种纤维素酶都是市场上常见的商业产品，有效含量高，价格低廉，是国家批准饲用的饲料添加剂，不存在任何安全问题。本发明的混合酶成本低，使用方便，易于在生产实践中推广。经动物试验验证在饲料中添加复合纤维素酶能够显著提高动物的生产性能、氨基酸表观消化率、料重比和常规养分消化率。
具体实施例方式本发明所用到的纤维素C1酶为内切葡聚糖酶，可作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4糖苷键，切断长链的纤维素分子，形成小分子的纤维素，分解出新的非还原性末端。第二种Cx酶为外切葡聚糖酶，与游离末端结合，作用于非还原端切下纤维二糖单位，分解出一个纤维二糖分子。第三种纤维素酶是β 2葡萄糖苷酶，作用是将纤维二糖水解形成动物机体能够吸收的葡萄糖分子。这三种纤维素酶可选用市售的产品，例如于上海晨易生物科技有限公司、苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司、和氏璧生物技术有限公司的产品。本发明通过胃蛋白酶-胰蛋白酶两步消化法是来测定不同纤维素酶组合对饲料的干物质、粗蛋白的消化率以及还原糖生成量，从中选出最优组合的最佳比例，然后再以最优酶组合的最佳比例和第三种酶进行同样的两两组合，最终来选出三种酶的最佳添加比例。本发明的复合纤维素酶具体制备方法如下将三种酶分别进行两两组合，每种组合设定五种比例，分别为0:100,25:75,50:50,75:25,100:0ο每种组合称取5份5. O g饲料样品，分别放入300 ml的三角瓶中，分别按0:100、25:75、50:50、75:25、100:0五中比例 添加O. 5%个水平的两种纤维素酶组合。每个样品加入40 ml胃蛋白酶液(4 mg/ml，溶于O. 9%的生理盐水中)，用O. 075 mol/1 HCl溶液将pH值调至2. 5，在温度为40°C、振荡速率为50 r/min的恒温振荡器上消化4 h,然后加入40 ml胰蛋白酶液(2 mg/ml,溶于O. 9%的生理盐水中)，用O.1 mol/1 NaOH溶液将pH值调至7.0，在上述相同条件下再消化4 h。消化结束后，用已知质量的滤纸抽滤消化物，并冲洗3 4次，未消化部分再在60°C下烘干，称重并储存。通过分析，最终确定维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶的质量比为 3 :3 :2。本发明的混合酶在上述的配比下可以高效的发挥三种酶的配合效应，比起其它的配比具有更好的纤维素降解率。本发明的复合物效果验证1.纤维素酶对不同品种生长猪养分消化率及氮平衡的影响各选取5头体重相近(25± I) kg、健康去势的鲁农2号生长猪，分别放入50X150cm规格的镀锌代谢笼中适应I周后进行试验。猪舍温度保持在20±1 °C，相对湿度45% 55%。每天7 00和16 00定量喂料，总喂料量为体重的3% 4% ；自由饮水。采用玉米一豆柏型日粮，参考地方品种猪的饲养标准，以地瓜蔓为纤维来源，提高饲粮的纤维水平(ADF水平)，其它养分含量一致。本试验纤维素酶组合的添加水平分别为0%、0. 05%,O. 1%、0. 15%、O. 2%，S卩1、I1、II1、IV、V五组，其中0%为对照组。纤维素酶添加时采用逐级预混的原则，以保证纤维素酶混合均匀。试验采用5X5拉丁方设计。试验期每期7 d，前5 d为预试期，于第6、7 d连续收集48 h的粪样，混合均匀，按粪样重的10%、尿样体积的10%加入10%的H2SO4固氮后于一 20 1的冰箱中保存。结果表明，在饲料中添加O. 15%的纤维素酶，粗蛋白的消化率比对照组提高了 4. 42%，酸性洗涤纤维的消化率提高了 4. 0%，氮总利用率提高了 7. 06%ο2.纤维素酶对鲁农2号生长猪生产性能的影响选择健康、初始体重(25 ±1. 5)kg相近的鲁农2号生长猪120头，公母各半。试验日粮配方采用5. 8%ADF水平的高纤维水平日粮。将复合纤维素酶添加量设定为0%、0. 05%、.O. 10%,O. 15%、0. 20%五个水平，设为1、I1、II1、IV、V五组。试验猪随机分为5个处理，每个
处理3个重复，每个重复(圈)8头猪。高床饲养，自由采食，自由饮水。30天试验结束后计算料重比和日增重。结果表明，在饲料中添加O. 15%的复合纤维素酶能够有效的提高生产性能，并且能够明显的降低料重比。与对照组相比日增重提高了 4. 12%，料重比降低了 6. 9%。为了提高混合酶的效果，本发明在混合酶中加入了双歧杆菌活菌粉。1.1双歧杆菌活菌粉的制备将瘤胃双歧杆菌菌种(来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC1. 2273，冻干保藏)接种到PTYG改良液体培养基中活化培养，培养基上再加入已灭菌的液体石蜡，用以隔绝氧气，创造厌氧环境，37 °C培养32 h ;取活化后的培养液接种到PTYG改良液体培养基中扩大培养，接种量为1:10，37 1恒温培养32 h。取扩大培养液加入无菌离心管中，4 °C、7000 r/min离心10 min收集菌体(菌泥)，无菌操作倒出上清液，向离心管中加入保护剂50 g/L的甘露醇溶液、增量赋形剂100 g/L的脱脂乳粉溶液，混匀，分装，一 40 °C预冻1h，使之粘在管壁上，放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，至产品含水量为3 %左右即可。称取O. 5 g左右冻干菌粉，加人一定量灭菌PBS缓冲液，室温静置20 min，然后进行活菌记数。试验测得双歧杆菌活菌粉中活菌数为8. 47 X IO9 CFU/g。在80g混合酶(维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶的质量分别为30g、30g和20g)中加入双歧杆菌活菌粉10g，混合均匀完成制备。上述添加有双歧杆菌活菌粉的复合酶能够有效的提高纤维素酶的使用效果。在O. 15%纤维素组合酶组中加入双歧杆菌活菌粉，试验结束后，与对照组相比，料重比降低了
11.2%，同时日增重提高了 8. 6%。而且，双歧杆菌活菌粉能够促进养分消化率的提高，在纤维素酶对不同品种生长猪养分消化率及氮平衡的影响试验中，添加了双歧杆菌活菌的本发明的复合酶，与只添加本发明纤维素组合酶的对照组相比，粗蛋白的消化率提高了 5. 76%，酸性洗涤纤维的消化率提高了 4. 4%，氮总利用率提高了 5. 4%。上述结果证明添加双歧杆菌可以有效的提高本发明复合酶的纤维素降解率。本发明的复合酶可以用作饲料添加剂添加在含有纤维素的猪饲料中。
权利要求
1.一种用于降解纤维素的混合酶，其特征在于，所述的混合酶由纤维素Cl酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶组成，且纤维素Cl酶、纤维素Cx酶和纤维素β 2葡萄糖苷酶的质量比为3 3 :2。
2.权利要求1所述的混合酶，其特征在于，还加入了双歧杆菌活菌。
3.如权利要求2所述的混合酶，其特征在于加入后的双歧杆菌活菌的浓度为I 5X l(T9CFU/g。
4.权利要求1或2所述的混合酶作为猪饲料添加剂的应用。
全文摘要
本发明提供一种用于降解纤维素的混合酶，由纤维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β2葡萄糖苷酶组成，且纤维素C1酶、纤维素Cx酶和纤维素β2葡萄糖苷酶的质量比为332。为了增加混合酶降解纤维素的效果，在混合酶中加入了双歧杆菌活菌粉。本发明的复合纤维素酶克服了单一酶系功能不全的劣势，能够提高动物生产的生长性能、养分消化率和动物利用纤维素的能力，起到了一举多得作用。本发明的混合酶成本低，使用方便，易于在生产实践中推广。经动物试验验证在饲料中添加复合纤维素酶能够显著提高动物的生产性能、氨基酸表观消化率、料重比和常规养分消化率。
文档编号C12N9/42GK103013959SQ20131001736
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者宋春阳, 姜建阳, 聂昌林, 倪良振, 远德龙 申请人:青岛农业大学