专利名称：：一种降解纤维素的曲霉及其生产的菌剂的制作方法
技术领域：
：本发明一种纤维素降解菌及其生产的菌剂，属于生物
技术领域：
，是利用微生物的方法降解纤维素，对于农田秸秆腐熟及竹林地稻壳促腐具有较好的应用前景。二
背景技术：
：纤维素是世界上最丰富的可再生资源，但一直没有得到充分利用。我国是农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，但秸秆直接还田后在土壤中分解转化的周期长，难以作为当季作物的肥源。同时，每年约有30%的剩余作物秸秆不能有效处理和利用，在收割季节秸秆被集中焚烧的现象日益突出，污染空气并危害人们的身体健康。上世纪90年代以来，浙江省富阳、临安等竹林地采取稻壳覆盖早出技术，生产反季节竹笋，取得了显著的经济效益。但随着该技术使用年限的延长，也出现了一些问题。长期使用稻壳覆盖的竹林地，竹子地下鞭的生长受到影响，引起烂鞭、烂芽，造成竹林地退化，严重影响竹笋的产量与品质。因此研究农田秸秆、竹林地稻壳的人工快速促腐技术具有重要的意义。使用传统的物化方法，如酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法处理秸秆等纤维素，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本较高、带来新的环境污染等问题。而利用投加纤维素高效降解菌的方法经济、有效，正逐渐成为当前的研究热点。本专利是一株曲霉属真菌，既可以高效降解秸秆，对稻壳也有一定降解能力，对农田秸秆腐熟及竹林地稻壳促腐具有较好的应用前景。三
发明内容技术问题本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的降解纤维素的微生物菌剂，使用本菌剂可以在7d内降解41.87%的秸秆，31.59%的稻壳，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以縮短秸秆直接还田后在土壤中被微生物降解的周期，其代谢物可作为作物的肥源。技术方案下面为本发明的主要内容本发明提供一种纤维素降解菌，其特征在于，该菌株YN1分类命名为曲霉(Aspergillussp.)，2009年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3446。用上述的纤维素降解菌生产的纤维素降解菌剂，是通过以下方法生产而成1〕将权利要求1所述的菌株YN1接种于PDA平板培养基上培养3-5天，取自PDA平板培养基上生长的菌落接种于PDA液体培养基中，振荡培养2天；PDA平板培养基配制为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，水1000毫升；PDA液体培养基配制为，马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接种入0.5吨种子罐，培养至l亿个/ml，种子罐所用的质量百分比培养基配方为蛋白胨0.3%，朋4冊30.2%，酵母粉0.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐温-800.02%，羧甲基纤维素钠CMC-Na1%，pH6.0;33)将种子液按生产罐培养基的体积10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4〕在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.6-1.2，搅拌速度为160-170转/分，培养温度为28-32°C，全流程培养时间为48-72小时，发酵结束后菌体的有效活菌数达到1亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。有益效果本发明与现有技术相比具有有如下优点YN1菌株既可以高效降解秸秆，对稻壳也有一定降解能力，对农田秸秆腐熟及竹林地稻壳促腐具有较好的应用前景。YN1菌株经液体发酵培养，内切酶、外切酶、13_糖苷酶、木聚糖酶活及总纤维素酶活性分别为95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。YN1菌株经固体发酵培养，内切酶、外切酶、P_糖苷酶、木聚糖酶活和总纤维素酶活性分别为1192.2U/g、100.6U/g、136.9U/g、1118.OU/g禾P210.7U/g。YN1在7d内可降解41.87%的秸秆，31.59%的稻壳。发酵条件简单，操作方便，成本低廉，易于扩大化生产。具体实施例方式以下叙述本发明的实施例。本发明提供一种纤维素降解菌，其菌株YN1分离于采自堆肥的土壤样品，经鉴定为曲霉属(Aspergillussp.)。主要形态学特性为YN1在查氏琼脂培养基上生长迅速，菌落平坦并具有辐射状沟纹，质地丝绒状；菌落呈紫黑色，反面无色，后呈不同程度的黄色；分生孢子头为球形至辐射形；分生孢子梗发生于基质，近顶囊部分带淡黄褐色，壁平滑；产孢结构单层，分生孢子球形，壁显著粗糙，具剌。(—)纤维素降解菌YN1的液、固体发酵酶活测定液体酶活测定将YN1接种于PDA平板培养基上培养3-5天，菌饼接种至液体发酵培养基(同种子罐培养基)中3(TC，160r/min培养5天。发酵液离心后上清液即为粗酶液，分别以1%(W/V)羧甲基纤维素钠、1%的微晶纤维素、1%水杨苷、1%木聚糖及50!^滤纸为底物，测定纤维素内切酶、外切酶、P-糖苷酶、木聚糖酶和总纤维素酶活性。用拧檬酸缓冲液稀释酶液，于5(TC下反应30min(测木聚糖酶活反应10min，总纤维素酶活反应lh)，加3mL的3，5-二硝基水杨酸(DNS)，煮沸5min，紫外分光光度计540nm波长下测定吸光值，并计算酶活。以葡萄糖为标准，以lmL液体发酵液(或lg固体发酵物)lmin内催化产生1yg葡萄糖量所需要的还原能力作为1个酶活力单位(U)。固体酶活测定将YN1接种于PDA斜面上培养3-5天；用3ml无菌水清洗斜面曲霉孢子接种于固体发酵培养基(秸秆50g，KH2P040.05g，MgS047H200.025g，(NH4)2S04lg，蒸馏水lOOmL)中3(TC静置培养7天，取发酵培养物20g加蒸馏水100ml，4(TC恒温水浴浸提lh，其间每15min搅拌一次，过滤即得粗酶液。立即按DNS法(同液体酶活测定)测定还原糖含量，并计算酶活。结果见表1，液体培养条件下，5种酶活均在第3天达到最大值，内切酶、外切酶、P-糖苷酶、木聚糖酶活及总纤维素酶依次为95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。在固体培养条件下，5种酶活在第5天达到最大值，依次为1192.2U/g、跳6U/g、136.9U/g、1118.0U/g和210.7U/g。表1:菌株YN1液、固体发酵酶活测定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(二)纤维素降解菌YN1降解天然纤维素的失重测定将秸秆、稻壳在105t:下烘至恒重。分别以烘干的lg秸秆、稻壳、滤纸为唯一碳源配制液体发酵培养基，接入降解菌YN1，30°C，160r/min摇培7天，将发酵液过滤并将残留纤维素烘干称重，用减重法计算失重率。结果见表2，通过减重法测得YN1在7d内对秸秆的降解率为41.78%，相同条件下对稻壳的降解率为31.59%，该试验结果表明YN1对秸秆和稻壳具有较强的分解能力。表2纤维素降解菌YN1对秸秆、稻壳及滤纸失重测定<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1〕将菌株YN1接种于PDA平板培养基上培养3_5天，取自PDA平板培养基上生长的菌落接种于PDA液体培养基中，振荡培养2天；PDA平板培养基配制为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，水1000毫升；PDA液体培养基配制马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接种入0.5吨种子罐，培养至l亿个/ml，种子罐所用的质量百分比培养基配方为蛋白胨0.3%，朋4冊30.2%，酵母粉0.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐温-800.02%，羧甲基纤维素钠CMC-Na1%，pH6.0;3)将种子液按生产罐培养基的体积10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4〕在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.6-1.2，搅拌速度为160-170转/分，培养温度为28-32°C，全流程培养时间为48-72小时，发酵结束后菌体的有效活菌数达到1亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型'权利要求一种纤维素降解菌，其特征在于，该菌株YN1分类命名为曲霉(Aspergillussp.)，2009年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3446。2.—种用权利要求1所述的纤维素降解菌生产的纤维素降解菌剂，是通过以下方法生产而成1〕将权利要求1所述的菌株YN1接种于PDA平板培养基上培养3-5天，取自PDA平板培养基上生长的菌落接种于PDA液体培养基中，振荡培养2天。PDA平板培养基配制为马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，水1000毫升；PDA液体培养基配制马铃薯200克，葡萄糖20克，水1000毫升。2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的体积比10%接种量接种入0.5吨种子罐，培养至1亿个/ml，种子罐所用的质量百分比培养基配方为蛋白胨O.3%，NH4N030.2%，酵母粉O.05%，KH2P040.4%，MgS047H200.03%，CaCl22H200.03%，吐温-800.02%，羧甲基纤维素钠CMC-Na1%，pH6.0;3)将种子液按生产罐培养基的体积10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；4〕在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.6-1.2，搅拌速度为160-170转/分，培养温度为28-32°C，全流程培养时间为48-72小时，发酵结束后菌体的有效活菌数达到1亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。全文摘要本发明提供一种纤维素降解菌及其生产的菌剂，属于生物
技术领域：
，YN1菌种接种于PDA平板培养基、PDA液体培养基、种子罐培养基、生产罐培养，发酵结束后菌体的有效活菌数达到1亿个/ml以上。YN1菌株经液体发酵培养，内切酶、外切酶、β-糖苷酶、木聚糖酶活及总纤维素酶活性分别为95.7U/mL、14.6U/mL、20.5U/mL、71.6U/mL和26.6U/mL。YN1菌株经固体发酵培养，内切酶、外切酶、β-糖苷酶、木聚糖酶活和总纤维素酶活性分别为1192.2U/g、100.6U/g、136.9U/g、1118.0U/g和210.7U/g。YN1在7d内可降解41.87％的秸秆，31.59％的稻壳。文档编号C12N1/14GK101724570SQ20091023252公开日2010年6月9日申请日期2009年12月7日优先权日2009年12月7日发明者朱建春,李顺鹏,范宁杰,赵方圆,黄星申请人:南京农业大学被以下专利引用(1),