专利名称：随机突变改造的有机磷农药降解酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及通过基因工程改造的有机磷农药降解酶。
背景技术：
农药残留严重危害生态环境，危害人民群众的身体健康，是各国都需要面对的严峻问题。研究发现，不同地区的地下水、农作物及土壤都的遭受到了农药残留的污染。我国是农业大国，每年的农药使用量巨大，随之而来的农药残留问题也日趋严重。相关数据显示我国农产品的农药残留超标严重，居民日常膳食中的各类农药摄入量高于发达国家数十倍。近年来，农药残留的去除技术成为研究焦点，寻找一种安全、高效的去除农药残留的方法具有重要意义。农药降解酶是去除农药残留的有效技术手段，具有降解迅速、使用安全、环境友好等特点。目前已经发现了多种农药降解酶，例如有机磷农药降解酶0ΡΗ、有机磷农药降解酶ΜΡΗ、菊酯类农药降解酶BI等。其中，国内外对于有机磷农药降解酶研究的最为深入。有机憐农药降解酶 OPH 最先在 Flavobacterium sp.ATCC27551 (Mulbry and Karns, 1989)和Pseudomonas diminuta MG (McDaniel et al.，1988)中分离得到,有机憐农药降解酶 MPH首先由我国学者在Plesiomonas sp.strain M6中发现(崔中利等，2001)。有机磷农药降解酶OPH和MPH都具有广泛的降解谱，可以降解甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、敌敌畏等农药，是农药降解酶领域的关键酶。有机磷农药降解酶OPH的基因改造工作进行的比较深入，研究人员通过DNA shuffling技术成功将有机磷农药降解酶OPH对甲基对硫磷的降解活性提高`了 25倍(Catherine Mee-Hie Cho et al.，2002)，对毒死蜱的降解活性提高了 700多倍(Catherine Mee-Hie Cho et al.，2004)，这些成功的基因改造使OPH拥有了更优秀的酶学性质，有利于其在农药残留降解领域的应用，具有重要的实际应用价值。相对于有机磷农药降解酶0ΡΗ，有机磷农药降解酶MPH的基因改造并没有获得如此显著的成果。研究人员通过定点突变，使有机磷农药降解酶MPH获得了更优秀的热稳定性和酸喊稳定性(Jian Tian et al., 2010;Yidan Su et al., 2011 ；Lu Huang etal.，2012);通过随机突变手段，获得了一株突变位点为K173R的突变株，其对毒死蜱的降解效率比野生型酶提高了 41.55%(李亚楠等，2012)。有机磷农药降解酶MPH在基因改造方面的研究还有待于深入研究和开发，通过基因工程手段改造有机磷农药降解酶MPH，获得酶活力和热稳定性提高的突变体酶对于解决农药残留问题具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于利用基因工程手段改造有机磷农药降解酶MPH，使其获得更加优秀的酶活力和热稳定性。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:有机磷农药降解酶MPH的N端35个氨基酸为信号肽序列，本发明随机突变的对象为不含信号肽编码序列的成熟Hipd基因。
采用易错PCR的方法对Pseudomonas stutzeri strain ZK-5来源的有机磷农药降解酶MPH编码基因(mpd，GenBank登录号JQ686087)进行随机突变。易错PCR反应体系(50 μ L)为:mpd基因(GenBank登录号:JQ686087)50ng作为模板，上游引物和下游引物各0.3 μ M，dNTPs各 200μM，10μL突变缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，5 μ LPCR缓冲液。易错PCR反应条件为:94°C热变性5min，94°C热变性lmin，55°C退火lmin, 72°C延伸 lmin, 30 个循环。上游引物:5’ -GAATTCTGCAGCACCGCAGGTGCGCACC-3 ’下游引物:5’ -TCCGGAAGCTTTCATCATCACTTGGGGTTGACGACCG-3 ’突变缓冲液组成为:dTTP4mM,dCTP4mM, MgCl227.5mM, MnCl22.5mM,溶剂为去离子水。PCR缓冲液组成为:100mM Tris-HCl pH8.3, 500mM KCl andl5mMMgCl2，溶剂为去离子水。对随机突变获得的mpd突变基因进行表达，纯化突变酶，筛选酶活力和热稳定性提高的突变酶，经过大量筛选，获得I株随机突变改造的有机磷农药降解酶，其具有比野生型酶更优秀的酶活力和热稳定性。经测序，本发明的有机磷农药降解酶是通过取代具有氨基酸序列为SEQ ID N0.3的来源于Pseudomonas stutzeri strain ZK-5的有机憐农药降解酶MPH的I个氨基酸位点而产生的，所述的氨基酸位点是位于第71位的取代，在第71位的取代是用苏氨酸取代丝氨酸。本发明的有机磷农药降解酶三维结构如图5所示:本发明的有机磷农药降解酶为同亚基二聚体，活性中心为双锌离子金属活性中心，亚基的N末端通过氢键与另外一个亚基表面的凹槽结合，对二聚体结构的稳定性起到了关键作用。本发明的有机磷农药降解酶在第71位的取代发生在loop环上，该取代位点紧靠另外一个亚基的N末端，通过间接影响亚基的结合，进而影响酶活力和三维结构稳定性。本发明的有机磷农药降解酶通过上述位点的取代，获得了比野生型酶更优秀的酶活力和热稳定性。下面是随机突变可参见的文献:(I)Cadwell RC, Joyce GF(1992)Randomization of Genes by PCR Mutagenesis.Genome Res2:28-33.
(2)Rasila TS，Pajunen MIj Savilahti H(2009)Critical evaluation of randommutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia colimutator strain, and hydroxylamine treatment.Analytical Biochemistry388:71-80.
本发明所具有的优点本发明获得的随机突变改造的有机磷农药降解酶通过取代具有氨基酸序列为SEQID N0.3的来源于Pseudomonas stutzeri strain ZK-5的有机憐农药降解酶MPH的第71位氨基酸位点，获得了比野生型酶更优秀的酶活力和热稳定性。由于酶活力和热稳定性的提高，本发明的有机磷农药降解酶降解效率高，高温下不易失活，获得了更大的实际应用价值，能够广泛应用于农产品及自然环境中农药残留的降解，为彻底解决农药残留问题提供了一种有效途径。
图1本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶对毒死蜱和甲基对硫磷的比活力；图2本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶的热稳定性；图3对硝基苯酚标准曲线；图4毒死蜱标准曲线；图5本发明的有机磷农药降解酶三维结构图。
具体实施例方式实施例1:本发明的有机磷农药降解酶在大肠杆菌中的表达(I)PCR 扩增:用上游引物 5’ -ATTCATATGGCCGCACCGCAGGTG-3’ 和下游引物 5’ -TAACTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG-3’ PCR扩增本发明的有机磷农药降解酶基因。PCR (50 μ L体系)反应条件为:本发明的有机磷农药降解酶基因(SEQ ID N0.1)50ng作为模板，上游引物和下游引物各0.3μΜ，dNTPs各200 μ M，5U Taq DNA聚合酶，5 μ LPCR 缓冲液，30 个循环，94°C变性 5min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，最后一个循环 72°C延伸 lOmin。PCR 缓冲液组成为:IOOmM Tris-HCl pH8.3, 500mM KClandl5mMMgCl2,溶剂为去离子水。(2)表达载体构建:上述PCR产物经PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN)纯化(纯化产物经北京六合华大基因科技股份有限公司测序证明其为SEQ ID N0.1)，采用NdeI和XhoI双酶切，连接于同样被NdeI和XhoI双酶切的pET-30a质粒载体，构建连接有本发明的有机磷农药降解酶编码基因的重组pET-30a表达`载体。(3)转化宿主细胞:将上一步获得的重组pET_30a表达载体转化E.coliBL21(DE3)，获得基因工程菌，具体操作按照分子生物学实验指南(Sambrook J，RussellDW，第三版)。(4)本发明的有机磷农药降解酶的表达:将上述基因工程菌在含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB液体培养基中，370C，180rpm培养至对数生长期，而后按体积比1%的接种量将培养液接种于含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB液体培养基，37 0C，180rpm培养3小时后向其中加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导，将培养温度降到25°C，诱导表达10个小时。(5)本发明的有机磷农药降解酶的纯化:将上述诱导结束的菌体经过破碎并回溶于原发酵液体积1/10的0.lmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液，离心得到的上清液即为粗酶液，采用Ni离子亲和层析纯化本发明的有机磷农药降解酶，然后用pH7.4的PBS缓冲液透析除去杂质，并用pH7.4的PBS缓冲液将浓度稀释至100 μ g/ml (纯化产物经北京六合华大基因科技股份有限公司测序证明其为SEQ ID N0.2)。具体操作见分子生物学试验指南(Sambrook J, Russell DW,第三版)。SEQ ID N0.1GCCGCACCGC AGGTGCGCAC CTCGGCCCCC GGCTACTACCGGATGCTGCT GGGCGACTTTGAAATCACCG CGCTGTCGGACGGCACGGTG GCGCTGCCGG TCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGA AGACGCAGAG CGCGCTGGCCAAGTCCTTCC AGAAAGCGCC GCTCGAAACCTCGGTCACCG
GTTACCTCGT CAACACCGGC ACCAAGCTGG TGCTGGTGGACACTGGCGCGGCCGGCCTGT TCGGCCCCAC CCTGGGCCGGCTGGCGGCCA ACCTCAAGGC CGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGA GATCTACATC ACCCACATGC ACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGG GTGAGCAACT GGCGTTCCCGAACGCGGTGG TGCGTGCGGA CCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCA GACCAACCTC GACAAGGCCC CGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAG GCGCCATGGC CTCGCTGAACCCCTATGTGA AGGCCGGCAA GTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCT GGTGCCCGGC ATCAAAGCGC TGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACA CCACCTACGT GGTCGAAAGCCAGGGGCAAA AGCTCGCCCT GCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGT GCAGTTCGAC GACCCCAGCG TCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGT CCGTCGCGGT GGAGCGCAAG`
AAGGCCTTCG CGGATGCCGC CAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCA CCTGTCGTTC CCCGGCATCG GCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACC GTTTCGTGCC GGTGAACTACTCGGTCGTCA ACCCCAAGTG ASEQ ID N0.2AAPQVRTSAP GYYRMLLGDF EITALSDGTV ALPVDKRLNQPAPKTQSALA KSFQKAPLET SVTGYLVNTG TKLVLVDTGAAGLFGPTLGR LAANLKAAGY QPEQVDEIYI THMHPDHVGGLMVGEQLAFP NAVVRADQKE ADFffLSQTNL DKAPDDESKGFFKGAMASLN PYVKAGKFKPF SGNTDLVPG IKALASHGHTPGHTTYVVES QGQKLALLGD LILVAAVQFD DPSVTTQLDSDSKSVAVERK KAFADAAKGG YLIAASHLSF PGIGHIRAEGKGYRFVPVNY SVVNPKSEQ ID N0.3AAPQVRTSAP GYYRMLLGDF EITALSDGTV ALPVDKRLNQPAPKTQSALA KSFQKAPLET SVTGYLVNTG SKLVLVDTGAAGLFGPTLGR LAANLKAAGY QPEQVDEIYI THMHPDHVGGLMVGEQLAFP NAVVRADQKE ADFffLSQTNL DKAPDDESKGFFKGAMASLN PYVKAGKFKP FSGNTDLVPG IKALASHGHTPGHTTYVVES QGQKLALLGD LILVAAVQFD DPSVTTQLDSDSKSVAVERK KAFADAAKGG YLIAASHLSF PGIGHIRAEGKGYRFVPVNY SVVNPK实施例2:本发明的有机磷农药降解比活力的测定分别以甲基对硫磷和毒死蜱作为底物，测定本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶的比活力。
野生型酶的生产方法为:以有机磷农药降解酶基因mpd (GenBank登录号:JQ686087)作为PCR模板，其他操作步骤完全按照实施例1的方法进行。
以甲基对硫磷为底物，比活力的测定方法如下:(I)对硝基苯酚标准溶液的制备:以20 μ M Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备对硝基苯酚浓度为10 μ Μ、20 μ Μ、30 μ Μ、40 μ Μ、50 μ Μ、60 μ M的对硝基苯酚标准溶液。(2)对硝基苯酚标准曲线的绘制:将不同浓度的对硝基苯酚标准溶液于410nm波长下测定吸光度，横坐标为对硝基苯酚浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。(3)吸取 980 μ L20 μ M 的 Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液、10 μ L 甲基对硫磷溶液(IOmg/ml，溶剂为乙醇)，置于2.2mL离心管中，30°C温浴IOmin后加入10 μ L经实施例1纯化的浓度为100yg/ml的本发明的农药降解酶或野生型酶，立即于30°C下震荡反应lmin，反应结束后立即加入20μ L6mol/L盐酸终止反应，然后取0.5mL终止反应液，用浓度为0.05mol/L的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ρΗΙΟ.0)定容至5mL，410nm波长下测定吸光度，以先加入6mol/L盐酸的试样作为空白对照，对照对硝基苯酚标准曲线(图3)，计算酶活力和比活力。以甲基对硫磷为底物，酶活力(U)定义为:在30°C，pH8.0的条件下，Imin反应生成I μ mo I对硝基苯酚所需要的酶量。比活力=酶活力(U)/每mg酶蛋白(4)比活力计算公式:X= (AX 10.2X0.001)/(kX0.1X0.01X1)式中:X——比活力(U/mg)A——吸光度10.2——酶促反应体系被稀释的倍数0.001-酶促反应体系体积(L)k——对硝基苯酚标准曲线斜率0.1-酶液浓度(mg/ml)0.01-酶液体积(ml)1-反应时间(min)以毒死蜱为底物，比活力的测定方法如下:(I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.1% (体积百分比)吐温80的20 μ MTris-HCl(ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、60μΜ
的毒死蜱标准溶液。(2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。(3)酶活力检测:吸取
2.91πι120μΜ的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液、30 μ L毒死蜱溶液(10mg/ml，溶剂为乙醇)、30 μ L10% (体积百分比)的吐温80溶液(溶剂为20 μ M的Tris-HCl ρΗ8.0缓冲液)、30 μ L经实施例1纯化的浓度为ΙΟΟμ g/ml的本发明的有机磷农药降解酶或野生型酶，置于石英比色杯，混合均匀后于30°C下反应lmin，291nm波长下检测反应前后吸光度的变化，对照毒死蜱标准曲线(图4)，计算酶活力和比活力。以毒死蜱为底物，酶活力(U)定义为:在30°C，pH8.0的条件下，Imin降解I μ mo I毒死蝶所需要的酶量。比活力=酶活力(U)/每mg酶蛋白。
(4)比活力计算公式:X= (A1-A2) X 0.003/ (k X 0.1 X 0.03 X I)式中:X——比活力(U/mg)A1——反应前吸光度A2-反应后吸光度0.003-酶促反应体系体积(L)k——毒死蜱标准曲线斜率0.1-酶液浓度(mg/ml)0.03-酶液体积(ml)`
1-反应时间(min)本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶的比活力测定结果如图1所示，在以毒死蜱作为底物的情况下，本发明的有机磷农药降解酶的比活力是野生型酶比活力的4.6倍；在以甲基对硫磷作为底物的情况下，本发明的有机磷农药降解酶的比活力是野生型酶比活力的2倍。本发明的有机磷农药降解酶具有比野生型酶优秀的酶活力。实施例3:本发明的有机磷农药降解酶热稳定性的测定将实施例1中获得的经纯化的浓度为ΙΟΟμ g/ml的本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶分别于 40°C、42.5°C、45°C、47.5°C、50°C、52.5°C、55°C、57.5°C、60°C 中热处理IOmin后，立即放置于冰上保持30min，以毒死蜱为底物，测定酶活力，分析热稳定性。野生型酶的生产方法为:以有机磷农药降解酶基因mpd (GenBank登录号:JQ686087)作为PCR模板，其他操作步骤完全按照实施例1的方法进行。酶活力的测定方法如下:(I)毒死蜱标准溶液的制备:以含有0.1% (体积百分比)吐温80的20 μ MTris-HCl(ρΗ8.0)缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、60μΜ
的毒死蜱标准溶液。(2)毒死蜱标准曲线的绘制:将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。(3)酶活力检测:吸取
2.91πι120μΜ的Tris-HCl (ρΗ8.0)缓冲液、30 μ L毒死蜱溶液(10mg/ml，溶剂为乙醇)、30 μ L10% (体积百分比)的吐温80溶液(溶剂为20 μ M的Tris-HCl ρΗ8.0缓冲液)、30 μ L经上述热处理的浓度为ΙΟΟμ g/ml的本发明的有机磷农药降解酶或野生型酶，置于石英比色杯，混合均匀后于30°C下反应lmin，291nm波长下检测反应前后吸光度的变化，对照毒死蜱标准曲线(图4)，计算酶活力。以毒死蜱为底物，酶活力(U)定义为:在30°C，pH8.0的条件下，Imin降解I μ mol毒死蜱所需要的酶量。(4)酶活力计算公式:X= (A1-A2) X 0.003/ (kX 0.03 X I)式中:X-酶活力(U/ml)A1——反应前吸光度A2-反应后吸光度0.003-酶促反应体系体积(L)k——毒死蜱标准曲线斜率0.03-酶液体积(ml)
I——反应时间(min)
经上述热处理后，本发明的有机磷农药降解酶和野生型酶的酶活力测定结果如图2所示，本发明的有机磷农药降解酶的T50 (酶活力损失一半时的温度)为50°C，高于野生型酶的T50 (48.5°C)。本发明的有机磷农药降解酶具有比野生型酶优秀的热稳定性。
权利要求
1.随机突变改造的有机磷农药降解酶，其特征在于: 所述的随机突变改造的有机磷农药降解酶具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的随机突变改造的有机磷农药降解酶，其特征在于: 它是通过取代具有氨基酸序列为SEQ ID N0.3的来源于Pseudomonas stutzeristrain ZK-5的有机磷农药降解酶MPH的I个氨基酸位点而产生的，所述的氨基酸位点是位于第71位的取代；在第71位的取代是用苏氨酸取代丝氨酸； 使所述的随机突变改造的有机磷农药降解酶具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。
3.—种权利要求1所述的随机突变改造的有机磷农药降解酶的编码基因，编码基因DNA分子，其具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及通过基因工程改造得到的有机磷农药降解酶。本发明所述的一种随机突变改造的有机磷农药降解酶，它是通过取代来源于施氏假单胞菌的有机磷农药降解酶的1个氨基酸位点而产生的，所述的氨基酸取代位点是位于第71位的取代。本发明所述的有机磷农药降解酶不但对毒死蜱和甲基对硫磷的降解活性更加优秀，而且还具有优秀的热稳定性。
文档编号C12N15/55GK103146665SQ20131004454
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者张惠文, 谢建飞, 徐明恺, 张成刚, 石元亮, 卢宗云 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所