专利名称：转基因细胞培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因细胞培养装置，属于医疗和实验室设备技术领域。
背景技术：
转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术Transgenetechnology。人们常说的〃遗传工程"、〃基因工程"、〃遗传转化〃均为转基因的同义词。比如动物转基因就是基因组中含有外源基因的动物，这些动物是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。动物转基因技术已在牛、羊、猪、鸡、鱼等家养动物中取得一定成果，比如通过生长素基因、多产基因、促卵素基因、高泌乳量基因、瘦肉型基因、角蛋白基因、抗寄生虫基因、抗病毒基因等基因转移，可育成生长周期短，产仔、生蛋多和泌乳量高，肉类、皮毛品质与加工性能好，并具有抗病性的动物品种。在转基因技术研究过程中，细胞培养是最基本的实验操作，没有细胞，一切都无从谈起。目前，在细胞培养过程中，为了达到特定目的，需要将转基因细胞如牛成纤维细胞等方便快速地培养起来，整个过程需要较大的物质消耗，特别是灭菌过程，所使用的器具越多，需要消耗的物品越多，实验成本也随之增加，所以，有关细胞的实验都需要大量的资金支持，否则就无法完成。经过长期的实践观察，我们发现细胞培养装置在转基因实验过程中的使用量是最大的，也是最难控制的一个环节，有时一个小失误就可能造成大面积的污染，给实验带来较大的影响。因此减小污染的机会就变得非常重要，如何设计一种可以降低细胞培养装置使用量并使培养的转染细胞能够在一个密闭的环境中可以被挑拣转移进而降低培养的转染细胞被污染的机会成为急需解决的一大难题，所以利用在细胞培养装置内增加细胞生长的贴壁面积从而降低细胞培养装置使用量和加设一个可以手控的挑拣装置的方法，发明一种具有多层结构和挑拣装置可 供细胞贴壁生长并可在装置外手工挑拣目的细胞的转基因细胞培养装置是必要的。
发明内容
为了克服细胞生物学实验过程中因细胞培养装置使用过多和传代培养过程中多次转移细胞过程中常给实验增加各种风险的难题，本发明提供了一种转基因细胞培养装置，该转基因细胞培养装置利用在细胞培养装置内增加多层可供细胞贴壁生长的生长板，设置液盒来保证每块生长板均可使其上的细胞得到充足的培养液，同时设置可在装置外由操作人员手动操作的挑拣装置，从而达到较好完成细胞培养的目的。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
本发明的转基因细胞培养装置由瓶盖1、瓶口 2、瓶头3、瓶颈4、瓶上面5、瓶下面6、瓶体7、瓶腔8、支撑柱9、生长板10、透液板11、液盒上腔12、生长板插孔13、液盒14、瓶底15、瓶侧壁16、透液板体17、板间支撑18、支撑轴19、生长板卡槽20、托层立壁21、托层22、吸液层23、生长透液贴壁层24、透液孔25、支撑轴孔26组成，其特征在于:生长板10由托层立壁
21、生长透液贴壁层24、吸液层23、托层22、透液孔25、支撑轴孔26组成，生长板10长4_14厘米，宽2.5-7厘米，厚1-3毫米，包括三层结构，从上到下依次为生长透液贴壁层24、吸液层23、托层22。生长透液贴壁层24是一层纤维膜，厚0.01-0.1毫米，上面有很多透液孔25，吸液层23中从液盒14中吸附过来的培养液可以通过透液孔25顺利地渗透到生长透液贴壁层24膜的外表面，以利接种在膜外表面上细胞的生长；吸液层23是一层脱脂棉，厚度为0.69-1.9毫米，可以吸附培养液；托层22塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，厚0.3-1毫米，前缘和两侧缘向上折起，形成托层立壁21，以免培养液向外渗出。支撑轴孔26是生长板10上与支撑轴19相对应处的长条孔，长度为3-13厘米、宽度为2.1-3.1毫米，用于支撑轴19穿插生长板10后，与板间支撑18 —起将生长板10固定在特定位置，以及生长板10可以以支撑轴孔26边缘和支撑轴19形成滑道，从板与板之间推进或拉出，以便观察生长板上细胞的生长情况，或者在生长板10进行清洗死亡细胞、挑拣单克隆细胞等操作。所述的瓶盖I外形塑料质地，外形及结构同公知的瓶盖，盖口内表面有凸出的旋丝，可与瓶头3外表面外凸的旋丝相互旋接在一起，以便瓶盖I将瓶口 2封住，防止瓶腔8中液体流出。瓶口 2是瓶头3游离端的开口，即外加液体注入瓶腔8或瓶腔8内的液体流出的开口。瓶头3是瓶颈4末端向外伸出的一段圆环形结构，内表面光滑，夕卜表面有外凸的旋丝。瓶颈4是瓶头3和瓶体7之间相连接的部分，下面长，上面短，使得瓶头3位于瓶体7中轴面的上方，以免细胞培养装置放置在水平面上后，液体从瓶口 2流出，瓶颈4内腔与瓶头3和瓶腔8连成一体。所述的瓶体7长方体形，长5-15厘米，宽3-8厘米，高2_5厘米，其壁厚1_3毫米，质地为塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，前面没有瓶壁，是个开口，放置在水平面上后，上面为瓶上面5，下面为瓶下面6，两侧为瓶侧壁16，后面为瓶底15，其内由各个面围成的空腔为瓶腔8。所述的支撑柱9是连接于瓶上面5和瓶下面6正中柱形结构，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括板间支撑18、支撑轴19、生长板卡槽20。板间支撑18圆柱形环套，内径为2.2-3.2毫米，外径为3-4毫米，长度为2-3毫米；支撑轴19是支撑柱9中央的轴，圆柱形，直径为2-3毫米；上下两个板间支撑18之间的缝隙形成生长板卡槽20，用于卡住生长板10，使得相邻两块生长板10之间相距2-3毫米。所述的透液板11是连接瓶体7两侧壁和下壁的长方体形板，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括生长板插孔13和透液板体17两部分，长2.8-6.4厘米，宽1.6-3.8厘米，厚度为1-3毫米。生长板插孔(13)由细胞培养生长板插孔(49)和单克隆筛选生长板插孔(51)组成，是生长板(10)后面伸出的插头插入后浸浴在液盒(14)内培养液中的孔道，长度为0.5-1厘米，宽度为0.1-0.3厘米，位于透液板体17的两边，同时也可以和支撑柱(9)形成生长板(10)的支撑结构，相邻两个生长板插孔(13)之间上下相距2-3毫米。所述的液盒14是透液板11与瓶底15之间的形成的盒状结构，由胰蛋白酶溶液槽38、D-hanks液体槽39、筛选培养液槽40、 废液槽41、缓冲液槽42、生长培养液槽43、转染试剂槽44、质粒槽45、质粒孵育液槽46、转染试剂孵育液槽47、注射器针头插孔48、细胞培养生长板插孔49、废液排出孔50、单克隆筛选生长板插孔51组成，用于盛纳培养液；液盒上腔12为透液板11与瓶上面5之间的空间，是培养液进出液盒14的开口。
所述的挑拣装置37由吸力胶头27、瓶盖转球28、伸缩封管29、玻璃管30、单向进气阀31、单向控气阀32、玻璃管颈33、挑细胞管34、进细胞口 35、出细胞口 36组成；吸力胶头27是市售的胶头滴管用的胶头，直径为0.5-1厘米，长度为1-2厘米，胶头壁厚度为1-2毫米，胶头口处圆筒形，直径为0.5厘米，长度为0.5-1厘米；瓶盖转球28为直径为1-1.5厘米的圆球形密封件，由外壳和内球组成，外壳圆片形，共2片，每片的直径为1-1.5厘米，厚度为0.5-0.75厘米，可用螺栓将瓶盖转球28固定在瓶盖I底面上，同时两片外壳通过叠在一起形成的圆柱体，在该圆柱体中央有一个直径为0.75-1.25厘米的圆球形空间，以便固定直径为0.75-1.25厘米的内球在此空间中被固定并可在其中转动；过内球中央有一个直径为0.5厘米的孔道，是玻璃管30插入的空间，当玻璃管30插入内球孔道后，操作者将吸力胶头27套在玻璃管30 —端，由于内球可以自由转动而且密封性能好，操作者就可以控制挑拣装置的瓶内部分进行操作；伸缩封管29为塑料质可伸缩的长管，上口直径为
0.75-1.25厘米，下口直径为0.5厘米，结构同公知牛奶吸管的弯处，可以伸缩，整个伸缩封管29套在玻璃管30的外面；玻璃管30是直径为0.5厘米玻璃质地的长管，总长度为整个装置内部长度，壁厚1-2毫米，外端从瓶盖转球28穿出瓶盖1，开口处有微孔滤膜封住；内端连接在玻璃管颈33中央，内腔与玻璃管颈33的内腔相通；单向进气阀31位于玻璃管30上伸缩封管29内端内侧0.5-1厘米处，结构同公知的单向进气阀，可让装置内的气体单向进入玻璃管30腔；单向控气阀32结构同公知的单向控气阀，位于玻璃管30内端部内，当吸力胶头27被捏或松开时，可以在玻璃管颈33和挑细胞管34形成一股吸力，让被挑拣的细胞从进细胞口 35进入挑细胞管34，然后由出细胞口 36出来，进而被放置在特定位置；玻璃管颈33是玻璃管30末端延伸的部分，基部结构同玻璃管30，然后逐渐变细，与挑细胞管34相连处的直径为0.2-0.3厘米，整个玻璃管颈33的长度为1-2厘米；挑细胞管34弧形，弧度为10-30°，长度为1-2厘米，进细胞口 35在前，口径为1-2毫米，开口方向与玻璃管颈33前端开口方向一致；出细胞口 36在后，口径为2-3毫米，开口方向与玻璃管颈33前端开口方向相反。所述的制造转基因细胞培养装置时，先生产出细胞培养装置的上下两部分，然后在下部的里面加上透液板11形成液盒14，插入生长板10，在生长板10的支撑轴孔26上下放置板间支撑18，插入支撑轴19，使支撑轴19下端连接在瓶下面6的内表面上，然后将细胞培养装置的上下两部分热合在一起即成。本发明的有益效果为，转基因细胞培养装置利用在细胞培养装置内增加多层可供细胞贴壁生长的生长板，设置液盒来保证每块生长板均可使其上的细胞得到充足的培养液，同时设置可在装置外由操作人员手动操作的挑拣装置，从而达到较好完成细胞培养的目的。转基因细胞培养装置制作简单，功能多样，可操作性强，成本低廉，效果明显。
下面结合附图对本发明进一步说明。图1为本发明转基因细胞培养装置的整体结构示意图。图2为本发明转基 因细胞培养装置的透液板的结构示意图。图3为本发明转基因细胞培养装置的支撑柱的结构示意图。图4为本发明转基因细胞培养装置的生长板的结构示意图。图5为本发明转基因细胞培养装置的挑拣装置的结构示意图。
图6为本发明转基因细胞培养装置的液盒的结构示意图。图中1.瓶盖，2.瓶口，3.瓶头，4.瓶颈，5.瓶上面，6.瓶下面，7.瓶体，8.瓶腔，
9.支撑柱，10.生长板，11.透液板，12.液盒上腔，13.生长板插孔，14.液盒，15.瓶底，16.瓶侧壁，17.透液板体，18.板间支撑，19.支撑轴，20.生长板卡槽，21.托层立壁，
22.托层，23.吸液层，24.生长透液贴壁层，25.透液孔，26.支撑轴孔，27.吸力胶头，28.瓶盖转球，29.伸缩封管，30.玻璃管，31.单向进气阀，32.单向控气阀，33.玻璃管颈，34.挑细胞管，35.进细胞口，36.出细胞口，37.挑拣装置，38.胰蛋白酶溶液槽，39.D-hanks液体槽，40.筛选培养液槽，41.废液槽，42.缓冲液槽，43.生长培养液槽，44.转染试剂槽，45.质粒槽，46.质粒孵育液槽，47.转染试剂孵育液槽，48.注射器针头插孔，49.细胞培养生长板插孔，50.废液排出孔，51.单克隆筛选生长板插孔，52.生长板推拉环。·
具体实施例方式实施例一:
如图所示，本发明的转基因细胞培养装置具体为:由瓶盖1、瓶口 2、瓶头3、瓶颈4、瓶上面5、瓶下面6、瓶体7、瓶腔8、支撑柱9、生长板IO、透液板11、液盒上腔12、生长板插孔13、液盒14、瓶底15、瓶侧壁16、透液板体17、板间支撑18、支撑轴19、生长板卡槽20、托层立壁21、托层22、吸液层23、生长透液贴壁层24、透液孔25、支撑轴孔26、吸力胶头27、瓶盖转球28、伸缩封管29、玻璃管30、单向进气阀31、单向控气阀32、玻璃管颈33、挑细胞管34、进细胞口 35、出细胞口 36、挑拣装置37、胰蛋白酶溶液槽38、D-hanks液体槽39、筛选培养液槽40、废液槽41、缓冲液槽42、生长培养液槽43、转染试剂槽44、质粒槽45、质粒孵育液槽46、转染试剂孵育液槽47、注射器针头插孔48、细胞培养生长板插孔49、废液排出孔50、单克隆筛选生长板插孔51、生长板推拉环52组成。瓶盖I外形塑料质地，外形及结构同公知的瓶盖，盖口内表面有凸出的旋丝，可与瓶头3外表面外凸的旋丝相互旋接在一起，以便瓶盖I将瓶口 2封住，防止瓶腔8中液体流出。瓶口 2是瓶头3游离端的开口，即外加液体注入瓶腔8或瓶腔8内的液体流出的开口。瓶头3是瓶颈4末端向外伸出的一段圆环形结构，内表面光滑，外表面有外凸的旋丝。瓶颈4是瓶头3和瓶体7之间相连接的部分，下面长，上面短，使得瓶头3位于瓶体7中轴面的上方，以免细胞培养装置放置在水平面上后，液体从瓶口 2流出，瓶颈4内腔与瓶头3和瓶腔8连成一体。瓶体7长方体形，长5-15厘米，宽3-8厘米，高2-5厘米，其壁厚1-3毫米，质地为塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，前面没有瓶壁，是个开口，放置在水平面上后，上面为瓶上面5，下面为瓶下面6，两侧为瓶侧壁16，后面为瓶底15，其内由各个面围成的空腔为瓶腔8。支撑柱9是连接于瓶上面5和瓶下面6正中柱形结构，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括板间支撑18、支撑轴19、生长板卡槽20。板间支撑18圆柱形环套，内径为2.2-3.2毫米，外径为3_4毫米，长度为2_3毫米；支撑轴19是支撑柱9中央的轴，圆柱形，直径为2-3毫米；上下两个板间支撑18之间的缝隙形成生长板卡槽20，用于卡住生长板10，使得相邻两块生长板10之间相距2-3毫米。透液板11是连接瓶体7两侧壁和下壁的长方体形板，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括生长板插孔13和透液板体17两部分，长2.8-6.4厘米，宽1.6-3.8厘米，厚度为1_3毫米。生长板插孔(13)由细胞培养生长板插孔(49)和单克隆筛选生长板插孔(51)组成，是生长板(10)后面伸出的插头插入后浸浴在液盒(14)内培养液中的孔道，长度为0.5-1厘米，宽度为0.1-0.3厘米，位于透液板体17的两边，同时也可以和支撑柱(9)形成生长板(10)的支撑结构，相邻两个生长板插孔(13)之间上下相距2-3毫米。液盒14是透液板11与瓶底15之间的形成的盒状结构，用于盛纳培养液。液盒上腔12为透液板11与瓶上面5之间的空间，是培养液进出液盒14的开口。液盒14由胰蛋白酶溶液槽38、D-hanks液体槽39、筛选培养液槽40、废液槽41、缓冲液槽42、生长培养液槽43、转染试剂槽44、质粒槽45、质粒孵育液槽46、转染试剂孵育液槽47、注射器针头插孔48、细胞培养生长板插孔49、废液排出孔50、单克隆筛选生长板插孔51组成，胰蛋白酶溶液槽38位于液盒14上部一端，容积为5-10毫升，内盛有胰蛋白酶，胰蛋白酶的量根据细胞传代所需胰蛋白酶溶液的量来定，所用比例为0.25%。即按质量百分数于100毫升D-hanks液体中添加0.25克胰蛋白酶。D-hanks液体槽39容积为5-10毫升，内盛无钙镁离子的平衡盐缓冲液，pH 8.0。筛选培养液槽40容积为15-40毫升，用于盛装单克隆筛选生长板所需要的培养液，真核细胞筛选用氨基糖苷类抗生素G418，浓度为400-500微克/毫升；其上部有胰蛋白酶溶液槽38和D-hanks液体槽39，前面壁即透液板体17上的生长板插孔13，有5-7个，又称单克隆筛选生长板插孔51，每个单克隆筛选生长板插孔51长度为0.5-1厘米，宽度为0.1-0.3厘米，是培养单克隆细胞的生长板10插入和培养液进入生长板10的地方。废液槽41容积为20-50毫升，是收集转基因细胞培养过程中产生的各种废液的空间，其下部有废液排出孔50，以便废液储集量废液槽41容积一半时，在超净工作台上，将废液用无菌注射器抽出。废液排出孔50位于废液槽41下部，是个直径为1-2毫米、长度为3-5毫米、壁厚0.1-0.5毫米的玻璃管，废液排出孔50内端开口于废液槽41腔，外端口被一个直径为1-2毫米的橡胶皮套套住，以免细胞培养过程中外界细菌进入和废液溢出。缓冲液槽42容积为20-50毫升，内盛PBS磷酸盐缓冲液。因为在转基因细胞培养过程中，每进行一次操作，就必须对挑拣装置进行清洗，所需要的缓冲液较多，但是由于转基因细胞培养装置的空间有限，为了解决这一难题，在缓冲液槽42上部设置有注射器针头插孔48，以便注射器插入，同时注射器射出的液流也可以较好地冲洗挑拣装置等需要清洗的部件。注射器针头插孔48的结构同废液排出孔50，也是I个直径为1-2毫米、长度为3-5毫米、壁厚0.1-0.5毫米的玻璃管，内端开口于缓冲液槽42，外端口被一个直径为1-2毫米的橡胶皮套套住，以免细胞培养过程中外界细菌进入和缓冲液溢出。生长培养液槽43，容积为15-40毫升，用于盛装细胞培养生长板所需要的培养液，例如牛成纤维细胞生长所需培养液按体积百分数于90毫升DMEM培养基中添加10毫升标准胎牛血清，其上部有转染试剂槽44、质粒槽45、质粒孵育液槽46和转染试剂孵育液槽47，前面壁即透液板体17上的生长板插孔13只有I个，又称细胞培养生长板插孔49，每个细胞培养生长板插孔49长度为0.5-1厘米，宽度为0.1-0.3厘米，是培养转基因细胞的生长板10插入和培养液进入生长板10的地方。转染试剂槽44容积为3-5毫升，内盛有PEI聚乙烯亚胺转染试剂，该试剂排除了细胞培养中使用血清对转染效率的影响，且该试剂转染效率高、成本低、重复性好，能够很好的适用于牛成纤维细胞等的转染研究。质粒槽45容积为3-5毫升，内盛有根据转基因的目的进行选择的含有外源基因且希望其在宿主细胞中表达的质粒载体，比如线性化处理后的IRES-EGFP质粒绿色荧光蛋白基因的质粒表达载体，质粒浓度为I微克/微升，采用这种限制性内切酶提前对绿色荧光蛋白的表达载体IRES-EGFP进行酶切处理，使其成为线性化的载体片段，从而能够通过转染，更好地整合到牛成纤维细胞的基因组中，提高绿色荧光蛋白稳定表达的效率。质粒孵育液槽46容积为3-5毫升，内盛有DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)，为质粒的孵育溶液。转染试剂孵育液槽47容积为3-5毫升，内盛有DMEM培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基)，为转染试剂的孵育溶液。生长板推拉环52是直径为1-5毫米通过环柄连接在生长板10的前面的玻璃环，每块生长板前面设置3个生长板推拉环52，分别位于生长板10前面中间及中间与边缘之间的中间，当需要观察某一块生长板10上转基因细胞生长情况时，可以用挑拣装置拽动生长板10，让生长板10在支撑轴19上沿支撑轴孔26移动，并被拉至装置可以用倒置显微镜观察的位置。生长板10由托层立壁21、生长透液贴壁层24、吸液层23、托层22、透液孔25、支撑轴孔26组成，长4-14厘米，宽2.5-7厘米，厚1_3毫米，从上到下依次为生长透液贴壁层24、吸液层23、托层22。生长透液贴壁层24是一层纤维膜，厚0.01-0.1毫米，上面有很多透液孔25，一方面细胞 只有几个微米大小，0.01-0.1毫米的厚度足以为细胞生长提供可以浸没细胞的深度的培养液，另一方面，吸液层23中从液盒14中吸附过来的培养液可以通过透液孔25很顺利并源源不断渗透到膜的外表面，以利接种在膜外表面上细胞的生长；吸液层23是一层脱脂棉，厚度为0.69-1.9毫米，结合液盒14内液体的压力可以吸附培养液，形成生长板10的垫层；托层22塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，厚0.3-1毫米，前缘和两侧缘向上折起，形成托层立壁21，以免培养液向外渗出。支撑轴孔26是生长板10上与支撑轴19相对应处的长条孔，长度为3-13厘米、宽度为2.1-3.1毫米，用于支撑轴19穿插生长板10后，与板间支撑18—起将生长板10固定在特定位置，以及生长板10可以以支撑轴孔26边缘和支撑轴19形成滑道，从板与板之间推进或拉出，以便用倒置显微镜观察生长板上细胞的生长情况，或者在生长板10进行清洗死亡细胞、挑拣单克隆细胞等操作。挑拣装置37由吸力胶头27、瓶盖转球28、伸缩封管29、玻璃管30、单向进气阀31、单向控气阀32、玻璃管颈33、挑细胞管34、进细胞口 35、出细胞口 36组成。吸力胶头27是市售的胶头滴管用的胶头，直径为0.5-1厘米，长度为1-2厘米，胶头壁厚度为1-2毫米，胶头口处圆筒形，直径为0.5厘米，长度为0.5-1厘米，以便吸力胶头27在挑拣转基因细胞时套在玻璃管外端，通过捏松胶头，产生吹力和吸力，进而移动所需要的阳性克隆细胞株到指定的生长板
10。挑拣完毕后，将吸力胶头27取下，在火焰旁在玻璃管30外端口粘贴一层微孔滤膜，以便让外界空气中的氧气进入培养装置内，供细胞生长利用。瓶盖转球28为直径为1-1.5厘米的圆球形密封件，由外壳和内球组成，外壳圆片形，共2片，每片的直径为1-1.5厘米，厚度为0.5-0.75厘米，可用螺栓将瓶盖转球28固定在瓶盖I底面上，同时两片外壳通过叠在一起形成的圆柱体，在该圆柱体中央有一个直径为0.75-1.25厘米的圆球形空间，以便固定直径为0.75-1.25厘米的内球在此空间中被固定并可在其中转动。过内球中央有一个直径为0.5厘米的孔道，是玻璃管30插入的空间，当玻璃管30插入内球孔道后，操作者将吸力胶头27套在玻璃管30 —端，由于内球可以自由转动而且密封性能好，操作者就可以控制挑拣装置的瓶内部分进行操作。伸缩封管29为塑料质可伸缩的长管，上口直径为0.75-1.25厘米，下口直径为0.5厘米，结构同公知牛奶吸管的弯处，可以伸缩，整个伸缩封管29套在玻璃管30的外面，一方面可固定玻璃管30，另一方面可以进一步密封瓶口 2，防止细菌从瓶盖转球28中的缝隙进入装置内，也就是在玻璃管30抽出或插进瓶盖转球28时增设一道屏障，以减小细胞被污染的几率。玻璃管30是直径为0.5厘米玻璃质地的长管，总长度为整个装置内部长度，壁厚1-2毫米，壁上具有最小为I毫米的刻度，以便挑拣过程中精确吸取定量液体，外端从瓶盖转球28穿出瓶盖1，开口处有微孔滤膜封住，以供应细胞生长过程中所需要的氧气；内端连接在玻璃管颈33中央，内腔与玻璃管颈33的内腔相通。单向进气阀31位于玻璃管30上伸缩封管29内端内侧0.5-1厘米处，结构同公知的单向进气阀，可让装置内的气体进入玻璃管30腔。单向控气阀32结构同公知的单向控气阀，位于玻璃管30内端部内，当吸力胶头27被捏或松开时，可以在玻璃管颈33和挑细胞管34形成一股吸力，让被挑拣的细胞从进细胞口 35进入挑细胞管34，然后由出细胞口 36出来，进而被放置在特定位置。玻璃管颈33是玻璃管30末端延伸的部分，基部结构同玻璃管30，然后逐渐变细，与挑细胞管34相连处的直径为0.2-0.3厘米，整个玻璃管颈33的长度为1_2厘米。挑细胞管34弧形，弧度为10-30°，长度为1-2厘米，进细胞口 35在前，口径为1_2毫米，开口方向与玻璃管颈33前端开口方向一致；出细胞口 36在后，口径为2-3毫米，开口方向与玻璃管颈33前端开口方向相反。制造转基因细胞培养装置时，先生产出细胞培养装置的上下两部分，然后在下部的里面加上透液板11形成液盒14，插入生长板10，在生长板10的支撑轴孔26上下放置板间支撑18，插入支撑轴19，使支撑轴19下端连接在瓶下面6的内表面上，然后将细胞培养装置的上下两部分热合在一起即成。为验证本发明的实用性，即转基因细胞培养装置可执行细胞培养、质粒转染及筛选功能，在转基因细胞培养装置应用过程中，以牛成纤维细胞为例，经过多次实验，优选的具体操作如下:
①转染前I天，取对数生长期的牛成纤维细胞接种入转基因细胞培养装置的生长板10上，之后细胞的清洗、消化及培养分别采用液盒14不同槽中的PBS磷酸盐缓冲液、0.25%胰蛋白酶及牛成纤维细胞生长所需培养液，12小时后观察细胞的生长情况，以细胞贴壁面积占据整个生长板10的70-80%时为最佳的细胞生长及转染密度，挑选生长状态最好的细胞置于下面的生长板10上进行下一步转染的操作；
②于转基因细胞培养装置的液盒14相应槽中，分别盛有100微升DMEM培养基，其中I槽中盛有8微升的PEI转染试剂，另外I槽中加入4微升浓度为I微克/微升线性化处理后的IRES-EGFP质粒，在相应 的孵育槽中分别孵育5分钟。将2个槽中的试剂进行充分的混匀，并孵育15分钟，从而获得了 PEI转染试剂与IRES-EGFP质粒的复合物；
③于步骤②进行的同时，取步骤①中选取好的待转染的细胞，弃掉覆盖在其上的牛成纤维细胞生长所需培养液，采用2毫升的PBS磷酸盐缓冲液覆盖细胞，并轻轻晃转基因细胞培养装置以清洗细胞，然后弃掉PBS磷酸盐缓冲液，并重复I次该清洗步骤，之后于待转染的生长板10上从筛选培养液槽40中引入足量的牛成纤维细胞生长所需培养液；
④采用步骤②用挑拣装置37将获得的PEI转染试剂与IRES-EGFP质粒的复合物逐滴滴加到待转染的细胞表面，边滴加边轻晃转基因细胞培养装置的生长板10。然后置于37°C的CO2细胞培养箱中孵育4小时后，弃掉转基因细胞培养装置中生长板10的混合溶液，以2毫升的试剂瓶中的牛成纤维细胞生长所需培养液替换之。并于37°C的CO2细胞培养箱中继续培养；
⑤继续培养48小时后弃掉覆盖在其上的牛成纤维细胞生长所需培养液，采用2毫升的PBS磷酸盐缓冲液覆盖细胞，并轻轻晃转基因细胞培养装置以清洗细胞，然后弃掉PBS磷酸盐缓冲液，并重复I次该清洗步骤，于细胞的表面加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶细胞消化液，1-2分钟之后采用2毫升牛成纤维细胞生长所需培养液终止消化反应，并将细胞吹打混匀，然后接种传代至转基因细胞培养装置中的生长板10中，继续添加牛成纤维细胞生长所需培养液使该生长板10中的最终的溶液体积为20毫升。并于37°C的CO2细胞培养箱中继
续培养；
⑥继续培养24小时之后，转基因细胞培养装置中的生长板10中细胞呈现出贴壁生长的状态时，弃掉覆盖于细胞上的溶液，以20毫升试剂瓶中的浓度为400-500微克/毫升的真核细胞筛选用氨基糖苷类抗生素G418溶液替换之，以进行药物筛选。每隔2天更换I次G418溶液，于7天左右即可于倒置荧光显微镜下能够观察到若干由单个细胞形成的发出绿色荧光的阳性克隆细胞集落。即为本试剂盒制备的绿色荧光蛋白转基因牛成纤维细胞株。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明 精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书其等效物界定。
权利要求
1.转基因细胞培养装置由瓶盖(I)、瓶口(2)、瓶头(3)、瓶颈(4)、瓶上面(5)、瓶下面(6)、瓶体(7)、瓶腔(8)、支撑柱(9)、生长板(10)、透液板(11)、液盒上腔(12)、生长板插孔(13)、液盒(14)、瓶底(15)、瓶侧壁(16)、透液板体(17)、板间支撑(18)、支撑轴(19)、生长板卡槽(20)、托层立壁(21)、托层(22)、吸液层(23)、生长透液贴壁层(24)、透液孔(25)、支撑轴孔(26)、吸力胶头(27)、瓶盖转球(28)、伸缩封管(29)、玻璃管(30)、单向进气阀(31)、单向控气阀(32)、玻璃管颈(33)、挑细胞管(34)、进细胞口(35)、出细胞口(36)、挑拣装置(37)、胰蛋白酶溶液槽(38)、D-hanks液体槽(39)、筛选培养液槽(40)、废液槽(41)、缓冲液槽(42)、生长培养液槽(43)、转染试剂槽(44)、质粒槽(45)、质粒孵育液槽(46)、转染试剂孵育液槽(47)、注射器针头插孔(48)、细胞培养生长板插孔(49)、废液排出孔(50)、单克隆筛选生长板插孔(51)、生长板推拉环(52)组成，其特征在于:生长板(10)由托层立壁(21)、生长透液贴壁层(24)、吸液层(23)、托层(22)、透液孔(25)、支撑轴孔(26)组成，生长板(10)长4-14厘米，宽2.5-7厘米，厚1-3毫米，包括三层结构，从上到下依次为生长透液贴壁层(24)、吸液层(23)、托层(22);生长透液贴壁层(24)是一层纤维膜，厚0.01-0.1毫米，上面有很多透液孔(25)，吸液层(23)中从液盒(14)中吸附过来的培养液可以通过透液孔(25)顺利地渗透到生长透液贴壁层(24)膜的外表面，以利接种在膜外表面上细胞的生长；吸液层(23)是一 层脱脂棉，厚度为0.69-1.9毫米，可以吸附培养液；托层(22)塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，厚0.3-1毫米,前缘和两侧缘向上折起,形成托层立壁(21)，以免培养液向外渗出；支撑轴孔(26)是生长板(10)上与支撑轴(19)相对应处的长条孔，长度为3-13厘米、宽度为2.1-3.1毫米，用于支撑轴(19)穿插生长板(10)后，与板间支撑(18)—起将生长板(10)固定在特定位置，以及生长板(10)可以以支撑轴孔(26)边缘和支撑轴(19)形成滑道而从板与板之间推进或拉出，以便观察生长板上细胞的生长情况，或者在生长板(10)进行清洗死亡细胞、挑拣单克隆细胞等操作。
2.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的瓶盖(I)外形塑料质地，外形及结构同公知的瓶盖，盖口内表面有凸出的旋丝，可与瓶头(3)外表面外凸的旋丝相互旋接在一起，以便瓶盖(I)将瓶口( 2 )封住，防止瓶腔(8 )中液体流出；瓶口( 2 )是瓶头(3)游离端的开口，S卩外加液体注入瓶腔(8)或瓶腔(8)内的液体流出的开口 ；瓶头(3)是瓶颈(4)末端向外伸出的一段圆环形结构，内表面光滑，外表面有外凸的旋丝；瓶颈(4)是瓶头(3)和瓶体(7)之间相连接的部分，下面长，上面短，使得瓶头(3)位于瓶体(7)中轴面的上方，以免转基因细胞培养装置放置在水平面上后，液体从瓶口(2)流出，瓶颈(4)内腔与瓶头(3)和瓶腔(8)连成一体。
3.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的瓶体(7)长方体形，长5-15厘米，宽3-8厘米，高2-5厘米，其壁厚1-3毫米，质地为塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，前面没有瓶壁，是个开口，放置在水平面上后，瓶体(7)上面为瓶上面(5)，下面为瓶下面(6)，两侧为瓶侧壁(16)，后面为瓶底(15)，瓶体(7)内由各个面围成的空腔为瓶腔(8)。
4.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的支撑柱(9)是连接于瓶上面(5)和瓶下面(6)正中柱形结构，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括板间支撑(18)、支撑轴(19)、生长板卡槽(20);板间支撑(18)圆柱形环套，内径为2.2-3.2毫米，外径为3-4毫米，长度为2-3毫米；支撑轴(19)是支撑柱(9)中央的轴，圆柱形，直径为2-3毫米；上下两个板间支撑(18)之间的缝隙形成生长板卡槽(20)，用于卡住生长板(10)，使得相邻两块生长板(10)之间相距2-3毫米。
5.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的透液板(11)是连接瓶体(7)两侧壁和下壁的长方体形板，塑料质地或玻璃质地，优选玻璃质地，包括生长板插孔(13)和透液板体(17)两部分，长2.8-6.4厘米，宽1.6-3.8厘米，厚度为1_3毫米；生长板插孔(13)由细胞培养生长板插孔(49)和单克隆筛选生长板插孔(51)组成，是生长板(10)后面 伸出的插头插入后浸浴在液盒(14)内培养液中的孔道，长度为0.5-1厘米，宽度为0.1-0.3厘米，位于透液板体17的两边，同时也可以和支撑柱(9)形成生长板(10)的支撑结构，相邻两个生长板插孔(13)之间上下相距2-3毫米。
6.根据权 利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的液盒(14)是透液板(11)与瓶底(15 )之间的形成的盒状结构，由胰蛋白酶溶液槽(38 )、D-hanks液体槽(39 )、筛选培养液槽(40)、废液槽(41)、缓冲液槽(42)、生长培养液槽(43)、转染试剂槽(44)、质粒槽(45)、质粒孵育液槽(46)、转染试剂孵育液槽(47)、注射器针头插孔(48)、细胞培养生长板插孔(49)、废液排出孔(50)、单克隆筛选生长板插孔(51)组成，用于盛纳培养液；液盒上腔(12)为透液板(11)与瓶上面(5)之间的空间，是培养液进出液盒(14)的开口。
7.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的挑拣装置(37)由吸力胶头(27)、瓶盖转球(28)、伸缩封管(29)、玻璃管(30)、单向进气阀(31)、单向控气阀(32)、玻璃管颈(33)、挑细胞管(34)、进细胞口(35)、出细胞口(36)组成；吸力胶头(27)是市售的胶头滴管用的胶头，直径为0.5-1厘米，长度为1-2厘米，胶头壁厚度为1-2毫米，胶头口处圆筒形，直径为0.5厘米，长度为0.5-1厘米；瓶盖转球(28)为直径为1-1.5厘米的圆球形密封件，由外壳和内球组成，外壳圆片形，共2片，每片的直径为1-1.5厘米，厚度为0.5-0.75厘米，可用螺栓将瓶盖转球(28)固定在瓶盖(I)底面上，同时两片外壳通过叠在一起形成的圆柱体，在该圆柱体中央有一个直径为0.75-1.25厘米的圆球形空间，以便固定直径为0.75-1.25厘米的内球在此空间中被固定并可在其中转动；过内球中央有一个直径为0.5厘米的孔道，是玻璃管(30)插入的空间，当玻璃管(30)插入内球孔道后，操作者将吸力胶头(27)套在玻璃管(30)—端，由于内球可以自由转动而且密封性能好，操作者就可以控制挑拣装置的瓶内部分进行操作；伸缩封管(29)为塑料质可伸缩的长管，上口直径为0.75-1.25厘米，下口直径为0.5厘米，结构同公知牛奶吸管的弯处，可以伸缩，整个伸缩封管(29)套在玻璃管(30)的外面；玻璃管(30)是直径为0.5厘米玻璃质地的长管，总长度为整个装置内部长度，壁厚1-2毫米，外端从瓶盖转球(28 )穿出瓶盖(I)，开口处有微孔滤膜封住；内端连接在玻璃管颈(33)中央，内腔与玻璃管颈(33)的内腔相通；单向进气阀(31)位于玻璃管(30 )上伸缩封管(29 )内端内侧0.5-1厘米处，结构同公知的单向进气阀，可让装置内的气体单向进入玻璃管(30 )腔；单向控气阀(32 )结构同公知的单向控气阀，位于玻璃管(30)内端部内，当吸力胶头(27)被捏或松开时，可以在玻璃管颈(33)和挑细胞管(34)形成一股吸力，让被挑拣的细胞从进细胞口(35)进入挑细胞管(34)，然后由出细胞口(36)出来，进而被放置在特定位置；玻璃管颈(33)是玻璃管(30)末端延伸的部分，基部结构同玻璃管(30)，然后逐渐变细，与挑细胞管(34)相连处的直径为0.2-0.3厘米，整个玻璃管颈(33)的长度为1-2厘米；挑细胞管(34)弧形，弧度为10-30°，长度为1_2厘米，进细胞口(35)在前，口径为1-2毫米，开口方向与玻璃管颈(33)前端开口方向一致；出细胞口(36)在后，口径为2-3毫米，开口方向与玻璃管颈(33)前端开口方向相反。
8.根据权利要求1所述的转基因细胞培养装置，其特征在于:所述的制造转基因细胞培养装置时，先生产出转基因细胞培养装置的上下两部分，然后在下部的里面加上透液板(11)形成液盒(14)，插入生长板(10)，在生长板(10)的支撑轴孔(26)上下放置板间支撑(18)，插入支 撑轴(19)，使支撑轴(19)下端连接在瓶下面(6)的内表面上，然后将转基因细胞培养装置的上下两部分热合在一起即成。
全文摘要
转基因细胞培养装置，属于医疗和实验室设备技术领域，由瓶盖、瓶口、瓶头、瓶颈、瓶上面、瓶下面、瓶体、瓶腔、支撑柱、生长板、透液板、液盒上腔、生长板插孔、液盒、瓶底、瓶侧壁、透液板体、板间支撑、支撑轴、生长板卡槽、托层立壁、托层、吸液层、生长透液贴壁层、透液孔、支撑轴孔、挑拣装置组成，其特征在于生长板由托层立壁、生长透液贴壁层、吸液层、托层、透液孔、支撑轴孔组成，生长透液贴壁层是一层纤维膜，上面有很多透液孔，以利接种在膜外表面上细胞的生长；吸液层可以吸附培养液；托层塑料前缘和两侧缘向上折起，形成托层立壁，以免培养液向外渗出。转基因细胞培养装置制作简单，功能多样，可操作性强，成本低廉，效果明显。
文档编号C12M1/18GK103146578SQ20131010635
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者严云勤, 佟慧丽, 李树峰, 金慧然, 李光鹏 申请人:东北农业大学