专利名称：一种检测sted2基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种检测STED2基因突变的试剂盒。
背景技术：
STED2基因位于人类3号染色体短臂，编码一个重要的组蛋白修饰酶，可对组蛋白H3K36位点进行甲基化修饰。研究表明，H3K36以及另一位点H3K79是关键的两个组蛋白修饰位点，他们在基因转录延伸过程中起重要的调节作用[Berger S., 2007 ；Nature,447(7143):407-412]。对12例急性淋巴细胞系白血病进行全基因组测序发现，48 %的病例含有组蛋白修饰酶基因的突变，SETD2突变是其中之一 [Zhang J.，etal,2012 ；Nature,481(7380):157-163] 0我们课题组对一对三岁同卵双胞姐妹(一个发白血病，另一个则健康)，进行DNA全基因组测序。发现白血病女童组蛋白甲基化转移酶基因MLL (作用于H3K79位点)发生重排形成MLL-NRIP3融合基因。除此之外，还发现STED2基因也发生了两个无义突变。接下来我们对134例急性髓系白血病(AML)和107例急性淋巴细胞系白血病(ALL)进行了分析，发现STED2突变在AML和ALL中都有发生，并且在MLL重排和非重排的病例中也均有发生，其突变几率占总病例(241例)的5.4%。我们的研究发现，STED2在白血病中的突变类型有截短突变(truncating mutation)和错意突变(missense mutation),这些类型的突变均使STED2酶蛋白发生结构破坏，失去功能。另外在STED2基因中可发生多重突变。由于STED2基因突变的类型和多重性符合肿瘤抑制基因的特点，因此其功能的缺失在急性白血病的发病中起重要作用。因此检测病人血细胞中的STED2基因突变对白血病的诊断，分子病理分型，预后分析，用药指导和病程监测 都有重要的临床意义。然而，迄今为止，市场上还没有一种成熟的STED2的检测方法以及试剂盒
发明内容
:本发明要解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种检测STED2基因突变的试剂盒。本发明采用的技术方案为:一种检测STED2基因突变的试剂盒，该试剂盒包括扩增STED2基因的试剂和检测STED2基因突变的试剂。所述扩增STED2基因的试剂包括扩增STED2基因的PCR引物及相应的PCR反应试齐U，其中所述扩增STED2基因的PCR引物为针于STED2基因21个外显子设计的PCR引物，所述引物序列包括SEQID NO: 1-SEQ ID NO:64的序列。所述检测STED2基因突变的试剂包括用于检测STED2突变的测序引物，所述测序引物序列包括SEQ ID NO:65-SEQ ID NO:103的序列。所述试剂盒用于检测STED2基因突变的步骤包括:收集和用流式细胞仪分选病理血细胞，以及用作对照的正常细胞，然后提取这些细胞的基因组DNA作为模版待用，利用上述针对21个外现子的寡聚核苷酸引物，对所述DNA模板进行多聚酶链式反应(PCR)扩增，然后对PCR扩增产物进行DNA序列测定。将病理血细胞的STED2序列和正常对照细胞的STED2序列进行比对，找出候选突变序列。然后通过和已有的DNA序列数据库相比对，剔除人群多态序列，确定STED2突变结果。本发明所具有的有益效果:使用本发明涉及的方法和试剂盒，可以对STED2基因所有已知或未知的突变进行筛选和检测。其敏感性高，特异性强。本发明涉及的方法和试剂盒对STED2基因突变进行检测是迄今市场上比较全面准确的方法，其操作步骤简明扼要，非常适合临床使用的要求，因此具有显著的优点。本发明中涉及的试剂盒及检测方法适用于临床诊断为急性白血病患者的SETD2基因突变检测。 急性白血病患者的确定:临床诊断急性白血病的标准参照WH02008《造血与淋巴系统肿瘤分类》(Swerdlow，Steven H.Who Classification of Tumours of Haematopoietic and LymphoidTissues.4th ed.Lyon，France:1nternational Agency for Research on Cancer，2008.)。
图1为试剂盒的检测流程图。图2显示在STED2基因中可发生多种突变。突变的种类有:截断突变(truncatingmutation),错义突变(missense mutation)。突变在AML和ALL中均有发生；突变可以发生在MLL重排病例，也可发生在非MLL重排病例。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。实施例1一、白血病细胞的取材收集急性白血病患者的外周血5ml，提取单个核细胞置_70°C超低温冰箱或液氮中保存。 二、正常对照组织的取材
权利要求
1.一种检测STED2基因突变的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括扩增STED2基因的试剂和检测STED2基因突变的试剂。
2.根据权利要求1所述一种检测STED2基因突变的试剂盒，其特征在于:所述扩增STED2基因的试剂包括扩增STED2基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂，其中所述扩增STED2基因的PCR引物为针于STED2基因21个外显子设计的PCR引物，所述PCR引物序列包括 SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:64 的序列。
3.根据权利要求1或2所述一种检测STED2基因突变的试剂盒，其特征在于:所述检测STED2基因突变的试剂包括用于检测STED2突变的测序引物，所述测序引物序列包括SEQID N0:65-SEQ ID N0:103 的序列。
4.权利要求1-3任一项所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤:收集和用流式细胞仪分选病理血细胞，以及用作对照的正常细胞，然后提取这些细胞的基因组DNA作为模版待用，利用上述针对21个外现子的寡聚核苷酸引物，对所述DNA模板进行多聚酶链式反应(PCR)扩增，然后对PCR扩增产物进行DNA序列测定。将病理血细胞的STED2序列和正常对照细胞的STED2序列进行比对，找出候选突变序列。然后通过和已有的DNA序列数据库相比对，剔除人 群多态序列，确定STED2突变结果。
全文摘要
本发明涉及一种检测STED2基因突变的试剂盒，该试剂盒包括扩增STED2基因的试剂和检测STED2基因突变的试剂。所述扩增STED2基因的试剂包括扩增STED2基因的PCR引物及相应的PCR反应试剂，其中所述扩增STED2基因的PCR引物为针于STED2基因21个外显子设计的PCR引物，所述PCR引物序列包括SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:64的序列。所述检测STED2基因突变的试剂包括用于检测STED2突变的测序引物，所述测序引物序列包括SEQ ID NO:65-SEQ ID NO:103的序列。本发明试剂盒可以对STED2基因所有已知或未知的突变进行筛选和检测。
文档编号C12Q1/68GK103215352SQ201310107889
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月29日 优先权日2013年3月29日
发明者程涛, 王前飞, 竺晓凡, 袁卫平 申请人:中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)