专利名称：一株产菊粉酶细菌的制备方法
技术领域：
本发明所属微生物种类开发技术领域。本发明涉及一株产菊粉酶细菌的筛选和鉴定研究，适合工业化应用。
背景技术：
菊粉(Inulin)又名菊糖，源自于菊芋块根，是一种天然果糖聚合物，由D-呋喃果糖分子以β_(2，1)糖苷键连接而成的果聚糖。每个菊粉分子末端以α-(1，2)糖苷键连接一个葡萄糖残基，聚合度通常为2-60，平均聚合度为10，其中聚合度较低时(Dp = 2-9)则可称为低聚果糖。作为一种天然可溶性膳食纤维，菊粉几乎不被胃酸水解和消化，而在结肠中被大量有益微生物发酵，因而具备多种保健功能，如控制血脂、降低血糖、改善肠道功能、促进矿物质吸收等。菊粉不仅可以作为脂肪替代品应用于低能量食品生产，而且具有膳食纤维以及益生素的生理功能，是一种优秀的功能性食品基料。目前，菊粉广泛应用于医药保健业、食品工业等领域。。菊粉酶(Inulinase)是能够水解β _2，1_D_果糖苷键的一类酶，学名为β _2，1-D-果聚糖酶。它主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于植物的菊粉酶，其底物专一性较强，仅作用于菊粉；而由微生物产生的菊粉酶大部分都能水解含有β _2，I呋喃果糖苷健的糖，如菊糖、蔗糖和棉子糖，小部分仅能水解菊糖。菊粉酶按其水解果糖苷键的方式不同，可分为内切和外切两类。外切菊粉酶(EC 3.2.1.80)作用于菊粉链果糖末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，直至最后的葡萄糖，主要产物为果糖；内切菊粉酶(EC
3.2.1.7)仅作用于菊粉，随机断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要是菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖。因此可通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料，生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇、丙酮-丁醇或琥珀酸等产品。这些产品由于具有广阔的应用前景，促使国外很多学者从20世纪80年代就开始深入开展菊粉酶的研究。毫无疑问，微生物合成是生产大量的工业用酶的唯一方法，30年来许多学者致力于寻找生产菊粉酶的最好微生物，尤其是日本、韩国和欧洲在这方面积累了丰富资料。我国关于菊粉酶的研究始于20世纪90年代，主要研究集中于菌株筛选和酶学性质方面，并且正日益受到人们的重视。但目前能在工业中应用的产菊粉酶的菌株筛选和发酵研究进展比较缓慢，因此选育优良的产菊粉酶菌株和发酵条件是菊芋生产乙醇工程的核心环节。我们从从自然界中选育得到了一株高产菊粉酶的细菌菌株，目前还没对该菌株产菊粉酶进行相关报道。
发明内容
1.本发明涉及一株产菊粉酶细菌的制备，其特征在产菊粉酶细菌的制备方法，包括以下过程:步骤(一):在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌20天；步骤(二): 取步骤(一)土壤5克于内置50毫升无菌蒸懼水烧杯中，160r/min摇床震荡分散20分钟；步骤(三):取步骤(二 )稀释液0.2毫升涂布于筛选培养基，30°C培养5天，利用透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株，平板划线方法纯化培养，移入斜面保藏；步骤(四):将步骤(三)纯化后菌种接种于PDA培养基上培养5天，进行复筛；步骤(五):挑取步骤(四)中的菌株接种于发酵培养基进行发酵培养，30°C、160r/min摇振培养6d，提取菌株的总DNA作为模板，利用通用引物进行PCR反应，纯化；步骤(六):将步骤(五)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对得出菌名；步骤(七):鉴定后的菌种保存备用。2.根据本发明所述1，该菌株的16S rDNA序列长度为1455bp，产菊粉酶的该菌为巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)。3.根据本发明所述1，该菌株产菊粉酶的最佳发酵条件是:菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L, NaCl 5.0, K2HPO4.3Η203.0g/L,初始 ρΗ6.0, 250mL 发酵三角瓶装液量为 50mL,在30°C，160r/min 振荡培养 2d。
图1是BI菌株16S rDNA分子生物鉴定结果图，图2是不同碳源对菌株产菊粉酶活力的影响图，图3是不同氮源对菌株产菊粉酶活力的影响图，图4是初始pH对菌株产菊粉酶活力的影响图，图5是培养温度对菌株产菊粉酶活力的影响图，图6不同装液量对菌株产菊粉酶活力的影响图。
具体实施例方式本发明所述的涉及一株产菊粉酶细菌的制备包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:产高活力菊粉酶细菌的筛选I材料和方法1.1 材料1.1.1分离试样山东威海滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌20d。1.1.2主要试剂及仪器菊粉，化学纯，广州泽钰生物科技有限公司；3，5- 二硝基水杨酸，化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司；智能生化培养箱，宁波海曙莱特仪器厂；恒温振荡器，江苏省金坛市医疗器械仪器厂；721分光光度计，北京市六一仪器厂。1.2培养基筛选培养基(g/L):菊粉10.0, MgSO4.7Η200.5，NaNO3L 5，ΝΗ4Η2Ρ042.0, KCl 0.5，FeSO4.7Η2040.1，K2HPO4L 0，琼脂 20.0，初始 ρΗ6.0。发酵培养基(g/L):菊粉20.0、酵母膏 5.0、NaCl5.(KK2HPO4.3Η203.0，初始 ρΗ6.0。
PDA培养基(g/L):马铃薯(去皮，切碎)200.0，葡萄糖20.0，琼脂20.0，pH自然。斜面培养基:查氏培养基。以上培养基在配置完成后，均需115°C高压灭菌30min。1.3菊粉酶活力测定3,5- 二硝基水杨酸法(DNS比色法):取0.5ml粗酶液，加人4ml用0.lmol/L,pH5.0的醋酸缓冲液配制的2%的菊粉溶液，50°C水浴中反应20min。沸水浴中5分钟终止反应。取反应液0.5ml加人1.5mlDNS混匀，沸水浴中反应5min，迅速冷却并稀释至20ml，在540nm处，用分光光度计测定其吸光度A，根据葡萄糖标准曲线计算生成的还原糖含量[3]。菊粉酶活力单位定义为:在 上述条件下,每分钟生成Iumol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。1.4产菊粉酶菌株的筛选1.4.1分离、初筛分组取土壤5g于内置50ml无菌蒸懼水的250ml锥形瓶中，30°C, 160r/min摇床20min。取稀释液0.2毫升涂布于筛选培养基，30°C培养5天，利用透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株，平板划线方法纯化培养，移入斜面保藏；1.4.2 纯化将分离、初筛后所得的菌株利用平板划线方法分离纯化，并重复进行多次分离，肯定为纯种菌后作为鉴定实验用的菌源。1.4.3 复筛(I)菌悬液制备:挑取一接种环菌体于50ml无菌生理盐水，充分均匀备用。(2)发酵培养:发酵培养基装量为50ml的250ml锥形瓶中加入以上菌悬液2ml，30°C发酵培养3天。(3)粗酶液制备:取发酵液于4000r/min离心lOmin，上清液即为粗酶液。进而进行酶活测定，筛选出酶活较高的菌株。1.5菊粉酶性质的测定通常用Ι/S的大小来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I是以菊粉作底物时的酶活，即菊粉酶酶活力；S是以蔗糖作底物时的酶活，即转化酶酶活力。测定筛得酶对2%的菊粉溶液的活性和2%蔗糖溶液的活性，计算出Ι/S值。一般认为当I/S > 10时，酶表现为内切活性；I/S < 10时，表现为外切酶活性。2结果与讨论2.1菌株筛选2.1.1初筛与纯化通过“透明圈”法筛选产菊粉酶活力较高的菌株，经平板划线纯化培养得到产酶活力较高的15株菌。2.1.2 复筛将初筛得到的15株菌经进一步进行摇瓶发酵，得到产酶活力相对较高的菌4株，经初步鉴定均为杆菌类。得到产菊粉酶活力见表I。表I细菌产菊粉酶活力(U/mL)
权利要求
1.本发明涉及一株产菊粉酶细菌的制备，其特征在产菊粉酶细菌的制备方法，包括以下过程: 步骤(一):在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌20天； 步骤(二):取步骤(一)土壤5克于内置50毫升无菌蒸懼水烧杯中，160r/min摇床震荡分散20分钟； 步骤(三):取步骤(二)稀释液0.2ml涂布于筛选培养基，30°C培养5天，利用透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株，平板划线方法纯化培养，移入斜面保藏； 步骤(四):将步骤(三)纯化后菌种接种于PDA培养基上培养5天，进行复筛； 步骤(五):挑取步骤(四)中的菌株接种于发酵培养基进行发酵培养，30°C、160r/min摇振培养6d，提取菌株的总DNA作为模板，利用通用引物进行PCR反应，纯化； 步骤(六):将步骤(五)纯化后的PCR产物送上海生工生物技术公司测序。将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种。采用ClustalW进行多序列比对得出菌名； 步骤(七):鉴定后的菌种保存备用。
2.根据本发明所述1，该菌株的16SrDNA序列长度为1455bp，产菊粉酶的该菌为巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)。
3.根据本发明所述1，该菌株产菊粉酶的最佳发酵条件是:菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L，NaCl 5.0, K2H PO4.3H203.0g/L，初始 ρΗ6.0，250mL 发酵三角瓶装液量为 50mL，在 30°C，160r/min振荡培养2d。
全文摘要
本发明所属微生物种类开发技术领域。本发明涉及一株产菊粉酶细菌的制备和发酵方法在滨海盐碱地菊芋生长的根际土壤，加入适量菊粉诱菌20天，取土壤5克于内置50毫升无菌蒸馏水烧杯中，震荡分散20分钟；取稀释液0.2毫升涂布于筛选培养基，30℃培养5天，利用透明圈法初筛出菊粉酶活力较高的菌株，平板划线方法纯化；然后接种于发酵培养基发酵培养6d，提取菌株的总DNA送上海生工生物技术公司测序；将测得的核苷酸序列输入GenBank数据库，进行Blast比对，获取与试验菌16S rDNA基因序列相似度高的菌种，采用ClustalW进行多序列比对得该菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)；该菌株产菊粉酶的最佳发酵条件是菊粉30.0g/L，酵母膏7.0g/L，NaCl5.0，K2HPO4·3H2O3.0g/L，pH6.0，250mL发酵三角瓶装液量为50毫升，在30℃，160r/min振荡培养2天。
文档编号C12R1/11GK103232956SQ20131012849
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月4日 优先权日2013年4月4日
发明者朱启忠, 张扬, 张瑞 申请人:山东大学(威海)