专利名称：一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法及其生产菌株。
背景技术：
几个世纪以来，天然产物尤其是高等植物的代谢产物一直是人类获得药物及其具有药理活性功能的活性物质的主要来源。世界上80%的人口主要依赖植物和植物提取成分维护生命和健康，天然药物及具有药理活性功能的天然产物在保障人类健康方面所发挥的作用愈加得到科学家的重视。原人参二醇属于植物三萜皂苷类化合物，是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化作用，还具有广泛抗肿瘤的作用。然而作为原人参二醇的主要来源植物，人参、西洋 参需要4到15年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍和病虫害的困扰，品质及其生长环境受到严重限制；同时人参、西洋参等中具有独特药理活性的原人参二醇含量稀少，抗癌成分含量甚微。总之，原人参二醇的天然获得存在着生长周期长，原材料含量低，提取技术复杂，纯度较低等困境。原人参二醇的人工合成是生物、化学和医药界长期关注和研究的领域。但由于这类化合物化学结构复杂，骨架上有多个手性结构，迄今为止，尚不能通过化学方法合成。近年来，通过基因工程手段在微生物中合成原人参二醇逐渐受到人们的关注。达玛烯二醇(Da_arenediol-1I)是原人参二醇合成的前体物，可衍生出原人参二醇。本发明人通过基因工程手段构建重组菌株，用以生产达玛烯二醇。
发明内容
本发明的目的是提供一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供用于生产达玛烯二醇的重组菌株。本发明设计思路和原理为:达玛烯二醇由2，3-环氧角藍烯(2,3-oxidosqualene)在达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol-1I synthase,简称DS)的催化下合成。与其他微生物相比，毕赤酵母(Pichia.pastoris)生长快、安全性高，且为模式生物,其代谢调控研究得比较清楚，特别是发现毕赤酵母自身能够合成达玛烯二醇的前体2，3-氧化角鲨烯，因此本发明人选用毕赤酵母作为合成达玛烯二醇的异源表达宿主。本发明提供了一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。本发明中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有:Ca)包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或者(b)与SEQ ID NO:1具有95%序列同一性的核苷酸序列。本发明的一个优选实施方案中，携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体为质粒pPICZa。
本发明的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。另一方面，本发明提供了另一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。本发明中，所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有:Ca)包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。本发明中，所述的2，3_环氧角鲨烯合成酶编码基因具有:(a)包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。本发明的一个优选实施方案中，所述的含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体为质粒 pPicZa。本发明的一个优选实施方案中，所述的含2，3_环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体为质粒Ppic9k。本发明的一个优选实施方案中，所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。另一方面，本发明提供了一种生物合成达玛烯二醇的方法，该方法包括:(I)发酵培养本发明所述重组毕赤酵母工程菌；(2)收集发酵液，获取达玛烯二醇。在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养的具体操作为:在BMMY发酵培养基中30°C，200rpm，发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。所述获取达玛烯二醇的具体操作为:取发酵液，离心收集菌体，加入10ml20%Na0H乙醇溶液破碎，破碎30min，IOml正己烷混匀，室温静置lOmin，取上清浓缩。本发明的有益效果本发明利用基因工程技术手段，实现了达玛烯二醇的生物合成。利用本发明的重组工程菌能提高达玛烯二醇的产量，降低生产成本，为原人参二醇的大规模工业化生产奠定了基础。
:图1:DS_pPicZa 质粒图谱图2:GS115-DS菌体胞内蛋白SDS-PAGE电泳检测图其中:泳道I 为GS115_pPic9k (阴性对照)菌体胞内蛋白；泳道2为GS115-DS菌体胞内蛋白。箭头所指为达玛烯二醇合成酶。图3:GS115-DS菌体胞内代谢产物TLC分析图谱其中:泳道I为GS115_Ppic9k胞内代谢产物；泳道2，3为GS115-DS胞内代谢产物；泳道4为达玛烯二醇标准品。箭头所指为达玛烯二醇。图4:MS质谱分析图谱其中:A为空白溶剂乙腈质谱分析(阴性对照)；B为达玛烯二醇标准品质谱分析；C为GS115-DS菌体胞内目标产物质谱分析。图中框出的部分图谱表明产物为达玛烯二醇。图5:GS115-DS-SS菌体胞内合成产物TLC分析图谱其中:泳道1为65115- 化91^菌体胞内合成产物；泳道2为GS115-SS菌体胞内合成产物；泳道5为达玛烯二醇标准品；泳道3，4，6，7，8，9分别为经甲醇诱导24h、48h、72h、96h、120h、144h后的GS115-DS-SS菌体胞内合成产物。箭头所指为达玛烯二醇。
具体实施例下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 实例中所用毕赤酵母GS115工程菌株,及其表达质粒均购自invrogen公司。实例中所用Cycle-pure试剂盒，Plasmid试剂盒，Gel Extraction试剂盒均购自OMEGA公司。限制性内切酶购自上海宝生Takara公司。实施例1达玛烯二醇合成酶表达载体的构建将人参基因组中达玛烯二醇合成酶基因GenBank:AB265170.1依据毕赤酵母GS115密码偏爱进行密码子优化，优化后的达玛烯二醇合成酶基因序列为SEQ ID N0:1，该基因由上海青兰生物科技有限公司合成。设计基因片段两端酶切位点AsuII和Xbal。分别利用引物F:5’ -TACTTCGAAATGGCCTGGAAGCAAAAAGGTGCTC-3’ 和 R:5 ’ -GCCTCTAGATTAAATTTTCAACTGCTGATGTTAG-3 ’ 进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件:940C，5min ；94°C，30S, 58°C，30S, 30 个循环；72°C, 2.5min ；72°C，IOmin0将PCR扩增产物与毕赤酵母表达质粒pPicZa (购自Invitrogen公司),经AsuII和XbaI双酶切，37°C酶切过夜后，酶切产物琼脂糖胶回收纯化。以酶切PCR产物与酶切线性化质粒PPicZa摩尔浓度10:1的设计连接体系，加入0.5ul T4连接酶，16°C连接过夜，将连接产物加入IOOul大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，42°C热击90s转化。加入ImlLB培养基，37°C复壮lh，收集菌体涂于博来霉素抗性筛选LB平板中，37°C培养过夜。隔日菌落PCR挑选阳性转化子，序列分析正确后，重组质粒命名为DS-pPICZa。质粒图谱如图1所示。实施例2达玛烯二醇合成酶重组表达工程菌的构建将阳性转化子接种于LB培养基中，37 0C，200rpm培养8h，收集菌体，常规方法提取重组质粒DS-pPICZa。SacI单酶切处理，37°C过夜，PCR纯化回收，收集于15ul水中，4°C保存待用。制备毕赤酵母GSl 15感受态细胞，加入SacI酶切处理后的DS-pPICZa质粒，混匀，冰浴放置5min,转入电转杯，1.98kv, 5.8ms,电击转化。加入Iml提前预冷的山梨醇,30°C,温浴30min。离心收集菌体，加入Iml YH)培养基，30°C 200rpm复壮Ih后，收集菌体，涂于100ug/ml博来霉素抗性筛选YPD平板，30°C，培养48h_72h。800ug/ml博来霉素抗性筛选高拷贝转化子，菌落PCR验证目的基因DS，成功转化的菌株命名为GS115-DS。
实施例3发酵培养与达玛烯二醇的生产将GS115-DS在BMMY发酵培养基中30°C，200rpm,发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。发酵96h后，离心收集菌体，溶于400ul超纯水中，超声破碎，SDS-PAGE分析检测GSl 15-DS胞内蛋白表达情况,实验结果如图2所示。已知达玛烯二醇合成酶蛋白分子量为88kda，图2中GS115-DS胞内蛋白所在泳道2与阴性对照泳道I相比，在90kda左右多出一条蛋白条带，即箭头所指位置，说明达玛烯二醇合成酶在GS115-DS胞内得到表达。取发酵液2mL，离心收集菌体，加入400ul20%Na0H乙醇溶液，破碎30min，400ul正己烷混匀，室温静置lOmin，取上清浓缩。以苯:丙酮(19:1)为展开剂，0.5%磷钥酸甲醇溶液为显色剂，将GS115-DS胞内代谢产物进行TLC分析，实验结果如图3所示，与阳性对照达玛烯二醇标准样品所在泳道4相比，GS115-DS胞内代谢产物所在泳道2，3中出现与达玛烯二醇相同极性的物质(即箭头所指位置)。取发酵液200ml，收集菌体，加入10ml20%Na0H乙醇溶液破碎，破碎30min，IOml正己烷混匀，室温静置lOmin，取上清浓缩。取上清浓缩点样制备TLC，以达玛烯二醇标准样品做对照。苯:丙酮(19:1)展开剂展开后，0.5%磷钥酸甲醇溶液显色。刮取与标准品相同位置处的硅胶，收集于1.5ml离心管中。丙酮萃取，离心取上清，蒸干，再溶于适量乙腈，进行MS分析。结果如图4所示，MS分析图谱与达玛烯二醇标准样品对应一致，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌株GS115- DS可以体内合成天然产物达玛烯二醇。实施例4通过2，3-环氧角鲨烯合成酶(SS)和达玛烯二醇合成酶(DS)双基因共表达生物合成达玛烯二醇以野生型酿酒酵母基因组为模板，设计PCR克隆上下游引物，分别为F:ATCGGATCCATGTCTGCTGTTAACGTTGCACCTG ；R:ATCGCGGCCGCTTAACCAATCAACTCAC。PCR 扩增条件如下表所示
权利要求
1.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶编码基因的表达载体。
2.权利要求1所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有: (a)包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或者 (b)与SEQID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。
4.一种用于制备达玛烯二醇的重组毕赤酵母工程菌，该重组毕赤酵母工程菌携带有含达玛烯二醇合成酶基因的表达载体和含2，3-环氧角鲨烯合成酶编码基因的表达载体。
5.权利要求4所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有: (a)包含SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或者 (b)与SEQID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。
6.权利要求4或5所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的达玛烯二醇合成酶编码基因具有: (a)包含SEQID NO: 2所示的核苷酸序列；或者 (b)与SEQID NO:具有95%序列同一性的核苷酸序列。
7.权利要求4至6中任一项所述的重组毕赤酵母工程菌，其中所述的毕赤酵母工程菌为毕赤酵母工程菌株GS-115。
8.—种生物合成制备达玛烯二醇的方法，该方法包括: Ca)发酵培养权利要求1至7中任一项所述重组毕赤酵母工程菌； (b)收集发酵液，获取达玛烯二醇。
9.权利要求8所述的制备达玛烯二醇的方法，其中所述的发酵培养的具体操作为:在BMMY发酵培养基中30°C，200rpm,发酵培养，每隔24h加0.5%的甲醇诱导。
全文摘要
本发明涉及一种达玛烯二醇的生物合成方法，并提供了达玛烯二醇的生产菌株。本发明通过基因工程技术手段构建得到的毕赤酵母工程菌株，能高效重组表达达玛烯二醇合成酶，进而合成原人参二醇合成的前体物----达玛烯二醇，也为最终实现原人参二醇的生物合成及大规模工业化生产奠定了基础。
文档编号C12N15/81GK103173368SQ20131012959
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者王华明, 黄涛, 原静, 黄亦钧 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司