专利名称：谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及l183q定点突变方法
技术领域：
本发明涉及一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。
背景技术：
DAHP合成酶是代谢流向芳香族氨基酸的第一个关键酶，编码基因为AroI，它催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤藓糖(E4P)合成3-脱氧-D-阿拉伯-7磷酸庚酮糖(DAHP)，进而生成分支酸，分支酸在色氨酸操纵子和其他酶的共同参与下最终转化为色氨酸，并分泌到胞外。随着分子生物学技术的飞速发展，在蛋白质定向进化技术和基因克隆表达方法相结合的基础上，使得催化活性提高的DAHP合成酶突变基因等位替换到基因组或在工程菌中过量表达成为可能，使代谢流向有利于色氨酸合成的方向，从而提高色氨酸产量。近年来，人们 对大肠杆菌的DAHP合成酶研究较为深入，在NCBI结构数据库中已收录了该酶的晶体结构，David L等人对Hisl80、Craig M等人对Cys61、Cys328分别做了定点突变，但催化活性都没有得到提高，国内复旦大学胡昌云等人确定了 AroGL175Q、AroGL175A、AroGL175D、Phe209Ser突变体酶催化活性分别提高1.33倍、1.57倍、1.65倍、
1.8倍，而对工业上生产氨基酸的主要菌种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的研究鲜见报道，唯有Liao H-F等人报道Ser 187对该酶的变构效应起到重要的作用。大肠杆菌的DAHP合成酶AroG基因150-189位与谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶Aro I基因158-197氨基酸高度保守，推断谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶L183Q突变体对该酶的催化活性也会有所提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供了一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现:谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法，所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332，大肠杆菌 DH5 α ；所述谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下:I)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于IOml LB液体培养基中，30°C摇床培养12h，次日2%接种量接入IOOml LB液体培养基；2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENE BANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID:1018979)及pET-28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物:上游引物Pl:5’ -TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCA CTCGAAA-3’；下游引物 P2:5’ -TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3’，其中下滑线部分为Nde I和Xho I酶切位点；3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增:以Pl，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式:95°C预变性4min，80°C pause 加入 Primer starHS 酶，之后 94°C 30s, 60°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,58°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,56°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,54°C 40s,72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 50°C 40s, 72°C 120s20个循环后；72°C延伸20min补加0.5 μ I Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5 μ I扩增产物用
I%的琼脂糖凝胶电泳检测；4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于_20°C，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-Simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分:回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体
0.5，SolutionI5,总体积10，在16°C连接过夜，用CaCl2法制备DH5 α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞；5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选；6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定；7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI ；所述L183Q定点突变，该突变过程如下:I)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，Ml:5’ -TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’ ；M2:5 ’ -TAGACATCCCAGAAGCCTGCTGGCGGTGCACCTGA-3 ’，其中下滑线为突变位点；2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD 18T_s imp Ie-Aro I为模板，以突变引物高保真循环PCR扩增，按下表体系扩增:
权利要求
1.谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于:所述方法所使用的材料为谷氨酸棒杆菌LG-332及大肠杆菌DH5 α ； 所述谷氨酸棒杆菌合成酶的基因克隆，该基因克隆步骤如下: . 1)、谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，谷氨酸棒杆菌LG-332单菌落接种于IOmlLB液体培养基中，30°C摇床培养12h，次日2%接种量接入100ml LB液体培养基； .2)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的引物设计与合成，根据GENEBANK公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 DAHP合成酶基因(aro I)核苷酸序列(GeneID:1018979)及pET_28a(+)原核表达载体的多克隆位点分析设计特异引物:上游引物Pl:5’ -TTTCATATGAGTTCTCCAGTCTCACTCGAAA-3 ’;下游引物 P2:5 ’ -TTTCTCGAGTTACTTGGCTGCTGCTCGGC-3 ’，其中下滑线部分为 NdeI和Xho I酶切位点； . 3)、谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的PCR扩增，以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板，进行降落PCR扩增:以Pl，P2为引物，反应条件采用热启动PCR方式:95°C预变性4min，80°C pause加入 Primer starHS 酶，之后 94°C 30s, 60°C 40s, 72°C120s2 个循环；94°C 30s, 58°C 40s,72°C 120s2 个循环；94°C 30s, 56°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C 30s,54°C 40s, 72°C 120s2个循环；94°C 30s, 52°C 40s, 72°C 120s2 个循环；94°C30s, 50°C 40s, 72°C 120s20 个循环后；72°C延伸20min补加.0.5 μ I Ex Taq酶加A尾，反应结束后取5 μ I扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测； .4)、PCR产物的回收，采用柱离心琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，回收的DNA贮存于_20°C，目的片段与克隆载体的连接，将回收的PCR产物连接到pMD18-T-Simple载体上，连接反应中各种反应组分及加样量重量比分:回收的PCR产物4.5，pMD18-T-simple载体.0.5，SolutionI5,总体积10，在16°C连接过夜，用CaCl2法制备DH5 α感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞； . 5)、重组质粒的转化和阳性克隆的筛选； . 6)、重组质粒的鉴定，采用碱裂解法提取质粒DNA，进行重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定; . 7)、重组质粒的核苷酸序列测定，对经上述步骤6)鉴定正确的阳性菌落进行过夜培养，制备成甘油菌，进行序列测定，测序正确的重组质粒命名为pMD18-T-simple-aroI ； 所述L183Q定点突变，该突变过程如下: . 1)、合成酶突变位点的选择，合成酶的定点引物的设计，根据所要突变的位点设计两条反向互补中间突变引物，Ml:5’ -TCAGGTGCACCGCCAGCAGGCTTCTGGGATGTCTA-3’ ； M2:5’ -TAGACATCCCAGAAGCCIGCTGGCGGTGCACCTGA-3’，其中下滑线为突变位点； . 2)、PCR扩增DAHP突变基因，以测序正确的重组质粒pMD18T-simpIe-AroI为模板，以突变引物高保真 循环PCR扩增，按下表体系扩增:
2.按照权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌合成酶基因克隆及L183Q定点突变方法，其特征在于:在基因克隆步骤I)所述的谷氨酸棒杆菌LG-332基因组DNA的提取，其提取基因组步骤如下: .1)、1OOml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液； .2)、加9.5mlTE悬浮沉淀，并加0.5ml 10% SDS, 50 μ I 20mg/ml (或Img干粉)蛋白酶K，混匀，37°C保温I小时； .3)、加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀； .4)、加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65°C保温20分钟； .5)、用等体积酚:氯仿:异戊醇(25: 24: I)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管； .6)、用等体积氯仿:异戊醇(24: I)抽提，取上清液移至干净管中； .7)、加I倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA； .8)、70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于ImlTE，-20°C保存，提取结束后取5μ 1，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌DAHP合成酶的基因克隆及L183Q定点突变方法。采用酶工程技术、分子生物学技术结合代谢工程理论和发酵工程技术等高新生物技术，利用底物结构类似物抗性突变株和苯丙氨酸、酪氨酸双营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，分别依据代谢工程理论，进行解除谷氨酸棒杆菌自身反馈调节、增强代谢流、增强色氨酸生物合成途径中关键酶的催化活性、增加底物生物合成量的研究，合理设计并改造谷氨酸棒杆菌的色氨酸生物代谢途径，得到产酸率和转化率符合合同要求的以玉米为原料生产饲料级L-色氨酸的基因工程菌。
文档编号C12N15/54GK103233032SQ20131013080
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者刘俊梅, 胡耀辉, 李琢伟, 王丹, 王玉华, 朴春红, 于寒松, 代伟长 申请人:吉林农业大学