一种生物法合成α-或β-蒎烯的方法
【专利摘要】本发明提供了从乙酰辅酶A合成α-或β-蒎烯的生物学方法以及能够合成α-或β-蒎烯的重组细胞，其中所用的乙酰辅酶A是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得的。所述方法包括：通过代谢工程技术将乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和蒎烯合酶转入到适当的宿主细胞中，将得到的重组细胞经过培养后，即可获得目的产物α-或β-蒎烯。
【专利说明】一种生物法合成Ct -或β -蒎烯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用生物法制备异戊二烯衍生物的方法。具体地，本发明涉及一种生 物法合成α_或β_菔烯的方法以及能够合成α_或β_菔烯的重组细胞，其中所用的乙 酰辅酶Α是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得的。
【背景技术】
[0002] 异戊二烯衍生物--菔烯是一种重要的平台化合物，由于菔烯二聚体的高能量密 度和燃烧净热值很高（能量密度：〇. 938g/cm3 ;燃烧净热值：39. 5MJ/L)，被广泛应用于高密 度燃料的合成。除此之外，还可以用于合成药理活性物、农用及家用生物活性物、功能材料、 香料、松油醇、芳香醇、乙酸松油酯、二氢松油醇、二氢月桂烯醇及高密度喷气燃料等。
[0003] 目前工业上获得菔烯的主要方法是采用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节 油中进行分离提取。这种方法存在对设备要求高，操作困难，能耗大，效率低等缺点，同时造 成大量自然资源的浪费。
[0004] 开展生物法制备菔烯的研究可以有效的解决高密度燃料存在的原料瓶颈问题。高 密度燃料是喷气燃料的重要成员之一，是喷气式飞机、导弹发动机的动力源，在导弹和航天 技术发展中起着重要的作用。由特定高密度化合物合成的高密度燃料与传统精馏高密度燃 料相比具有密度更大，燃烧热值更高，综合性能更好的特点，但同时也受到原料来源制约造 成成本居高不下。降低高密度燃料成本、开发可持续的高密度燃料的合成技术，以满足高密 度燃料在军事应用中的巨大缺口，解决高密度燃料原料不足问题具有重要战略意义。
[0005] 生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸 (MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和 高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体、细菌和藻类中。这两类代谢途径的最 终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate， DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯及其衍生物。
[0006] 此前，还没有利用微生物发酵获得菔烯的相关报道。本发明首次介绍了利用微生 物发酵获得菔烯的新方法。
【发明内容】
[0007] 本发明公开一种利用可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂制备异戊二烯衍 生物--α -或β -菔烯，建立可持续发展的异戊二烯衍生物--α -或β -菔烯合成工艺 路线。
[0008] 本发明主要通过基因工程手段对MVA途径合成异戊二烯衍生物--α -或β -菔 烯相关酶基因在大肠杆菌中进行外源表达。最终在大肠杆菌细胞内成功建立了一种异戊二 烯衍生物--α-或β-菔烯的生物合成途径。
[0009] 具体地，在第一方面中，本发明提供一种能够从乙酰辅酶Α合成α-或β-菔烯的 重组细胞，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰 辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊 酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重 组细胞通过基因工程技术将所述基因片段转入到适当的宿主细胞中而制备。其中可用的 宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在优选的是实施方案中，所述重组细胞为重组大 肠杆菌细胞，其能够在包含葡萄糖作为碳源的培养基中进行发酵培养，从乙酰辅酶A合成 α_或菔烯。
[0010] 其中所述乙酰辅酶Α酰基转移酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)来源于 其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
[0011] 所述3-轻-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)来源于 其它生物体，和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，编码具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
[0012] 所述轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌Ginterococcusfaecalis)，或3)来源于 其它生物体，和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相 似功能的蛋白的核酸序列。
[0013] 所述甲轻戊酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选 酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显 的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0014] 所述甲轻戊酸-5-磷酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生物体，和甲羟戊 酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0015] 所述甲轻戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生物体，和甲羟戊 酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序 列。
[0016] 所述异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生物体，和异戊烯焦 磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0017] 所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于：1)大肠杆菌（Escherichia coli)，或2)来 源于北美冷杉（Abiesgrandis),优选北美冷杉或3)来源于其它生物体，和香叶酯二磷酸合 成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0018] 所述菔烯合酶基因来源于：1)火炬松（Pinustaeda)，2)北美冷杉 (Abiesgrandis), 3)黄花蒿（ArtemiSia annua),或4)来源于其它生物体，和菔烯合酶基因 没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0019] 其中所用的宿主细胞为细菌细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞。
[0020] 在一个优选的实施方案中，通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因 (mvaE，SEQ ID N0:l)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因（mvaS，SEQ ID N0:2);来源于酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的甲轻戊酸激酶基因（ERG12，SEQ ID N0:5)，甲轻戊 酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQIDN0:6)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因（ERG19，SEQID N0 :7)，异戊烯焦磷酸异构酶基因（IDIl，SEQIDN0:8);来源于北美冷杉（Abi eSgrandiS) 的香叶酯二磷酸合成酶基因（GPPS2，SEQ ID NO :3)和来源于火炬松（Pinustaeda)的α -菔 烯合成酶基因（Pt30，SEQ ID NO :4)构建能够利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶Α生物合 成α-菔烯的重组大肠杆菌细胞。
[0021] 在另一个优选的实施方案中，通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰 辅酶Α酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶Α还原酶基因（mvaE，SEQ ID N0:l)，3-羟-3-甲 基戊二酰辅酶Α合酶基因（mvaS，SEQ ID NO :2);来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因 (ERG12，SEQ ID N0:5)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQ ID N0:6)，甲羟戊酸-5-二 磷酸脱羧酶基因（ERG19，SEQ ID N0:7)，异戊烯焦磷酸异构酶基因（IDI1，SEQ ID N0:8);来 源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因（GPPS2, SEQ ID NO :3)和来源于黄花蒿的β-菔 烯合成酶基因（QH6，SEQ ID NO :9)构建能够利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶Α生物合成 β-菔烯的重组大肠杆菌细胞。
[0022] 本领域技术人员应该理解，为在重组细胞中更好地表达，上述各种酶的基因序列 或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根据所用的宿主细胞的 密码子偏好性进行密码子优化。
[0023] 本领域技术人员还应该理解，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同 或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常规分子克隆技术克隆到宿主细胞中。另外，这 些核苷酸片段还可以与适当的表达控制元件（例如，启动子，增强子等）可操作地连接。这 些都在本领域技术人员的能力范围之内，不需要付出创造性的劳动。这些核苷酸片段可操 作性连接可以借助于接头也可以不用接头，这可以由本领域技术人员根据实际需要进行适 当的选择。
[0024] 在第二方面中，本发明提供一种生物法合成α -或β -菔烯的方法，所述方法包括 下述步骤：
[0025] Α)构建能够从乙酰辅酶Α合成α-或β_菔烯的重组细胞（即，本发明第一方面 的重组细胞），所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊 二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟 戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶；
[0026] B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，用适当的诱导剂 诱导，经过分离纯化后即可获得α-或β-菔烯。
[0027] 关于能够从乙酰辅酶Α合成α-或β_菔烯的重组细胞的构建可以参见本发明第 一方面的描述。
[0028] 本领域技术人员应该理解，在选择适当的宿主细胞构建好能够从乙酰辅酶Α合成 α -或β -菔烯的重组细胞后，本领域技术人员能够根据技术常识或经过有限次实验确定 合适的培养条件（例如，发酵培养的温度、搅拌速度、pH值、溶氧率、发酵时间等参数），也能 够选择合适的诱导剂，确定加入诱导剂的时机，等等。这不需要付出创造性的劳动。
[0029] 因此，本发明提供下列各项：
[0030] 1、一种生物法合成α -或β -菔烯的方法，所述方法包括下述步骤：
[0031] Α)构建能够从乙酰辅酶Α合成α -或β -菔烯的重组细胞，所述重组细胞包含下 述基因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶Α合酶、羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷 酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶；
[0032] B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，用适当的诱导剂 诱导，经过分离纯化后即可获得α-或β-菔烯。
[0033] 2、根据第1项所述的方法，其中所述乙酰辅酶Α酰基转移酶基因来源于： 1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明 显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0034] 3、根据第1项所述的方法，其中所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来 源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和3-轻-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基 因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0035] 4、根据第1项所述的方法，其中所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源 于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没 有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0036] 5、根据第1项所述的方法，其中所述甲羟戊酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生 物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸 序列。
[0037] 6、根据第1项所述的方法，其中所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因来源于：1)酿酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其 它生物体，和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能 的蛋白的核酸序列。
[0038] 7、根据第1项所述的方法，其中所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因来源于：1) 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源 于其它生物体，和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
[0039] 8、根据第1项所述的方法，其中所述异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于：1)酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它 生物体，和异戊烯焦磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋 白的核酸序列。
[0040] 9、根据第1项所述的方法，其中所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于：1)大肠杆 菌（Escherichia coli)，或2)来源于北美冷杉（Abiesgrandis)，优选北美冷杉或3)来源 于其它生物体，和香叶酯二磷酸合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
[0041] 10、根据第1项所述的方法，其中所述菔烯合酶基因来源于：1)火炬松 (Pinustaeda)，2)北美冷杉（Abiesgrandis)，3)黄花蒿（ArtemiSia annua)，或 4)来源于 其它生物体，和菔烯合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核 酸序列。
[0042] 11.根据第1项所述的方法，其中步骤A)所述的重组细胞通过基因工程技术将编 码乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、 甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、 香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶的基因片段转入适当的宿主细胞构建而成，其中所述宿主 细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。
[0043] 12、一种能够从乙酰辅酶A合成α -或β -菔烯的重组细胞，所述重组细胞包含下 述基因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶Α合酶、羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷 酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重组细胞通过基因工程技术将所述 基因片段转入到适当的宿主细胞中而制备。
[0044] 13、根据第12项所述的重组细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌 细胞。
[0045] 本发明的有益效果：
[0046] 与传统的制备工艺相比，利用微生物催化合成菔烯的路线具有如下的优势：（1) 由于有专一性的菔烯合成酶，所以生成的产物具有高选择性，工业上可以大大降低分离成 本；（2)使用的原料为木质纤维素降解获得的葡萄糖是可再生资源。（3)整个过程是在常温 常压下进行，能耗低。因此，利用生物催化手段制备菔烯将成为今后菔烯工业发展的必然趋 势。此外，微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉 价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有 效手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0047] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
[0048] 图1是利用乙酰辅酶A生物合成异戊二烯衍生物--α -或β -菔烯代谢途径示 意图。
[0049] 图2是pYJM3质粒图谱。
[0050] 图3是pYJM4质粒图谱。
[0051] 图4是pYJM5质粒图谱。
[0052] 图5是发酵产物菔烯结构的GC分析图谱。
[0053] 图6显示工程菌YJM28产α -菔烯的时间曲线。工程菌YJM28的α -菔烯产量 (▲)和细胞生长（)。当工程菌细胞生长12h开始进行诱导培养。
[0054] 图7显示诱导温度对工程菌α -菔烯的影响。当工程菌YJM28的细胞0D6(?达 0. 6-0. 9时，向培养基中添加终浓度为ImM的IPTG，分别在不同的温度下进行诱导培养29h : 25°C (白色），30°C (浅灰色），34°C (灰色），37°C (深灰色）。上述试验数据为重复三次 的平均值。
[0055] 图8显示IPTG浓度对工程菌产α -菔烯的影响。当工程菌YJM28的细胞0D_ 达0. 6-0. 9时，在诱导温度为30°C，不同终浓度IPTG的条件下诱导66h :0. lmM( )， 0· 25mM( ? )，0· 5mM( ▲ )，lmM( ·)。上述试验数据为重复三次的平均值。
[0056] 图9是发酵产物菔烯结构的GC分析图谱。
【具体实施方式】
[0057] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发 明并不限于这些具体的实施例。
[0058] 实施例1
[0059] 通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis)的乙酰辅 酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（mvaE，SEQ ID N0:1)，3-羟-3-甲 基戊二酰辅酶A合酶基因（mvaS，SEQ ID NO :2);来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因 (ERG12，SEQ ID N0:5)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8，SEQ ID N0:6)，甲羟戊酸-5-二 磷酸脱羧酶基因（ERG19, SEQ ID N0:7)，异戊烯焦磷酸异构酶基因（IDI1，SEQ ID N0:8); 来源于北美冷杉（Abiesgrandis)的香叶酯二磷酸合成酶基因（GPPS2, SEQ ID NO :3)和来 源于火炬松（Pinustaeda)的α-菔烯合成酶基因（Pt30, SEQ ID N0:4)，利用葡萄糖降解 中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯衍生物--α-菔烯。
[0060] 1. 1外源基因的克隆和表达载体的构建
[0061] 1.1.1外源基因的克隆
[0062] 1. 1. 1. 1粪肠球菌MVA上游代谢途径基因的克隆
[0063] 来自于奠肠球菌（Enterococcusfaecalis)的mvaS基因 （GenBank No. AAG02439), mvaE基因 （GenBank N〇.AAG02438)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载 体pGH (购自上海捷瑞生物工程有限公司）连接获得pGH/mvaS，pGH/mvaE。
[0064] 1· 1· 1. 2GPPS2, Pt30 基因的克隆
[0065] 分别对来自于 Abiesgrandis GPPS2 基因 （GenBank No. AF513112. 1)，Pinustaeda Pt30基因 （GenBank No. AF543530. 1)基因序列进行稀有密码子分析（http://www. genscript. com/cgi_bin/tools/rare_codon_analysis)，并将其稀有密石马子优化为 Ε· coli 偏好的密码子（ http://www.jcat.de/)。优化后的GPP合成酶基因（GPPS2)、菔稀合成酶基 因（Pt30)送上海捷瑞公司进行化学合成，并连入pGH载体上分别形成pGH-GPPS2，pGH-Pt30 载体。
[0066] 1. 1. 2表达载体的构建
[0067] 1. 1. 2. lpYJM24 载体构建
[0068] 将 pGH-GPPS2 载体与 pACYCDuet-Ι 载体（Novagen)分别用 Ndel 和 Bglll 进行双 酶切，载体与外源片段按摩尔比1 : 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4?6h，连接产物 转化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆， 从阳性克隆中提取重组质粒pYJM24(pACY-GPPS2)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0069] 1. 1. 2. 2pYJM26 载体构建
[0070] 将 pACY-mvaE-mvaS-ispSPa 载体（pYJM20,参见 Jianming Yang，Plos One， 2012D0I :10.1371/journal, pone. 0033509)与 pACY-GPPS2(pYJM24)载体分别用 Ncol 和PstI进行双酶切，载体pACY-GPPS2与外源片段mvaE-mvaS按摩尔比1 : 5的比 例，4°C连接过夜或16°C连接4?6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有 34 μ g · ml/1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒 PYJM26 (PACY-mVaE-mvaS-GPPS2)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0071] 1. 1. 2. 3pYJM27 载体构建
[0072] 将 pGH-Pt30 载体与 pYJM26 (pACY-mvaE-mvaS-GPPS2)载体分别用 Bglll 和 Xhol 进行双酶切，载体pACY-mVaE-mvaS-GPPS2与外源片段Pt30按摩尔比1 : 5的比例，4°C连 接过夜或16°C连接4?6h，连接产物转化E. coli DH5a，然后涂布加有34μ g · ml/1氯霉 素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM27 (pACY-mvaE-mva S-GPPS2-Pt30)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
[0073] 1. 1. 2. 4pYJM14 (pTrc-low)载体构建
[0074] 根据实验室建立的DNA组装（Lego DNA assembling)方法构建pTrc-low载体： 该方法是一种多个DNA片段在体外通过变性解链，退火组装成重组质粒的快速方法，连接 过程中无需任何限制性酶。在构建的过程中，通过PCR(simple PCR, overlap extension PCR，long tailed primer PCR)的方法扩增出一系列连续的片段（successive substrate fragments，SFs)，设计扩增这些片段时，需要在这些相邻片段之间存在一段比较长的重叠 部分，将这些片段按等摩尔比例混合后，变性，退火。由于片段和片段之间的重叠区较长，占 整个片段长度的1/3-2/3,使得变性后的单链很容易与相邻片段形成的单链进行杂交，最终 形成环状，将退火后的产物转化大肠杆菌后，最终可以形成重组质粒。pTrc-low载体构建过 程如下：
[0075] 分别以pTrchis2B骨架（来自Invitrogen公司）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)基因组为模板，扩增出质粒pTrchis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及 酿酒酵母MVA途径的下游4个基因的片段ERG 12 (SF128h 12，SFB12h 12) ;ERG8 (SF128h8， SF819h8) ;ERG19(SF819hl9, SF19IhI) ;IDI(SF19IhI， SFIBhl)，然后以这些片段或 pTrchis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠 PCR扩增出组装质粒的6个SFs片段SF128， SF819, SF19I，SFIB，SFB12, SFB。4 个基因 ERG12, ERG8, ERG19, IDI 之间的 3 个 RBS 序列是 在PCR扩增时，通过设计引物时引入，使得4个基因由单一的trc(trp-lac promoter)启动 子作用下进行表达。表1为pTrc-low质粒构建的过程中片段扩增的引物及模板，表2为所 用到的引物序列汇总。
[0076] 表1片段扩增的引物与模板
[0077] Table 1PCR templates and primers for fragment construction
[0078]
【权利要求】
1. 一种生物法合成α-或β-菔烯的方法，所述方法包括下述步骤： Α)构建能够从乙酰辅酶Α合成α-或β-菔烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基 因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶Α合酶、羟甲基戊二酰辅酶Α还 原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异 构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶； B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，用适当的诱导剂诱导， 经过分离纯化后即可获得α-或β-菔烯。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述乙酰辅酶Α酰基转移酶基因来源于： 1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明 显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来 源于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和3-轻-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基 因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源 于：1)酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌 (Enterococcusfaecalis)，或3)来源于其它生物体，和轻甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没 有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述甲羟戊酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae),优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它生 物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸 序列。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因来源于：1)酿酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其 它生物体，和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能 的蛋白的核酸序列。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因来源于：1) 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源 于其它生物体，和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或 相似功能的蛋白的核酸序列。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于：1)酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)，优选酿酒酵母，或2)来源于其它细菌，或3)来源于其它 生物体，和异戊烯焦磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋 白的核酸序列。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于：1)大肠杆 菌（Escherichia coli)，或2)来源于北美冷杉（Abiesgrandis)，优选北美冷杉或3)来源 于其它生物体，和香叶酯二磷酸合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功 能的蛋白的核酸序列。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述菔烯合酶基因来源于：1)火炬松 (Pinustaeda)，2)北美冷杉（Abiesgrandis)，3)黄花蒿（Artemisia annua)，或 4)来源于 其它生物体，和菔烯合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核 酸序列。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤A)所述的重组细胞通过基因工程技术将编 码乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、 甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、 香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶的基因片段转入适当的宿主细胞构建而成，其中所述宿主 细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。
12. -种能够从乙酰辅酶A合成α-或β-菔烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基 因片段：乙酰辅酶Α酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶Α合酶、羟甲基戊二酰辅酶Α还 原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异 构酶、香叶酯二磷酸合成酶和菔烯合酶，其中所述重组细胞通过基因工程技术将所述基因 片段转入到适当的宿主细胞中而制备。
13. 根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌 细胞。
【文档编号】C12N15/70GK104120148SQ201310156997
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】咸漠, 杨建明, 冯红茹, 张海波, 刘炜 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所