糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】一种糖化白蛋白酶法检测试剂盒，包括GA试剂1和GA试剂2，GA试剂1包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc2)、三水合亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·3H2O)、乙酸铜(CuAc2)和胆汁酸(Cholic?acid)；GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100(TritonX-100)和过氧化物酶。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法。
【专利说明】糖化白蛋白酶法检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]人体中的葡萄糖与血清蛋白的N-末端发生非酶促的糖基化反应，其中90%与血清蛋白链内第189位赖氨酸结合，形成高分子的酮胺结构，总称为糖化血清蛋白，其中90%以上为糖化白蛋白。因此，糖化白蛋白(Glycated Albumin, GA)可以反映糖化血清蛋白的总体水平。而在糖尿病的诊断与监测中，糖化蛋白质具有重要意义。血糖监测是糖尿病日常诊治工作中非常重要的一个环节，良好的血糖控制能有效延缓糖尿病急、慢性并发症的发生和发展。临床工作中要使血糖全面长期达标，短期平均血糖的良好控制非常重要。糖化白蛋白(glycatedalbumin, GA)是临床上血糖监测的指标之一，由于白蛋白在血液中的半衰期较短，所以在2-4周内即可观察到糖化白蛋白的变化，对于评价糖尿病患者近期血糖控制情况及反映短期内血糖水平的变化具有较高的临床价值。但现有的测定糖化蛋白质的组合物的特异性较低，灵敏度不高，获得检测结果的时间较长，操作方式复杂，检测结果不够准确可靠。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是的供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测到的糖化白蛋白(GA)浓度结果准确可靠的糖化白蛋白(GA)酶法检测试剂盒及其检测方法。
[0004]本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，包括GA试剂I和GA试剂2，GA试剂I包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc2)、三水合亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6.3H20)、乙酸铜(CuAc2)和胆汁酸(Cholic acid) ;GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100 (Triton X-100)和过氧化物酶。
[0005]本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其中所述GA试剂I采用如下步骤制成:
[0006](I)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH,控制pH在7.95-8.05之间；
[0007](2)、称取0.4g氨基安替比林(4-AAP)、0.88g乙酸钙(CaAc2)、0.02g亚铁氰化钾(K4Fe (CN) 6)和0.09g乙酸铜(CuAc2)，加入到步骤(1)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解；
[0008](3)、称取1g胆汁酸(Cholic acid)，加入到步骤(2)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节PH，控制pH在7.95-8.05之间；
[0009](4)、称取3kU蛋白酶K，加入到步骤(3)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解。
[0010](5)、最后用纯化水将步骤(4)得到的溶液定容至1000ml,用0.2 μ μ m滤器过滤，得到GA试剂I ;
[0011]所述GA试剂2采用如下步骤制成:
[0012](一)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH,控制pH在7.95-8.05之间；
[0013](二)、称取1.47g N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，加入到步骤(一)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解；
[0014](三)、用移液器吸取0.5ml曲拉通X-100 (Triton X-100)，加入到步骤(二)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间；
[0015](四)、称取10kU果糖氨基酸氧化酶和200kU过氧化物酶，加入到步骤(三)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解；
[0016](五)、最后用纯化水将步骤(四)得到的溶液中定容至1000ml,用0.2μ μπι滤器过滤，得到GA试剂2。
[0017]本发明的糖化白蛋白酶法检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤:
[0018]1、将6 μ I样本和240 μ I的GA试剂I混匀,37 °C孵育5分钟；
[0019]2、在546/700nm波长下测定吸光度Al，其中主波长为546nm，副波长为700nm ；
[0020]3、加60 μ I的GA试剂2混匀,37 °C孵育5分钟；
[0021]4、在546/700nm波长下测定吸光度Α2，计算Λ A = Α1-Α2 ；
[0022]5、使用校准品(标准血清)，选用与校准品对应的质控品，质控测定值应在规定的范围内，采用以下公式计算:
[0023]
【权利要求】
1.糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于:包括GA试剂I和GA试剂2，GA试剂I包括三羟甲基氨基甲烷、氨基安替比林(4-AAP)、蛋白酶K、乙酸钙(CaAc2)、三水合亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6.3H20)、乙酸铜(CuAc2)和胆汁酸(Cholic acid) ;GA试剂2包括三羟甲基氨基甲烷、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)、果糖氨基酸氧化酶、曲拉通X-100 (Triton X-100)和过氧化物酶。
2.按照权利要求1所述的糖化白蛋白酶法检测试剂盒，其特征在于: 所述GA试剂I采用如下步骤制成: (1)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH,控制pH在7.95-8.05之间； (2)、称取0.4g氨基安替比林(4-AAP)、0.88g乙酸钙(GaAc2)、0.02g亚铁氰化钾(K4Fe (CN) 6)和0.09g乙酸铜(CuAc2)，加入到步骤(1)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； (3)、称取1g胆汁酸(Cholicacid)，加入到步骤(2)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节PH，控制pH在7.95-8.05之间； (4)、称取3kU蛋白酶K，加入 到步骤(3)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解。 (5)、最后用纯化水将步骤(4)得到的溶液定容至1000ml，用0.2μym滤器过滤，得到GA试剂I ； 所述GA试剂2采用如下步骤制成: (一)、称取6g三羟甲基氨基甲烷(TRIS)于容器中，加适量水使其完全溶解，加入盐酸调节pH,控制pH在7.95-8.05之间； (二 )、称取1.47gN-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)，加入到步骤(一)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； (三)、用移液器吸取0.5ml曲拉通X-100 (Triton X-100)，加入到步骤(二)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解，加入盐酸或氢氧化钠溶液调节pH，控制pH在7.95-8.05之间； (四)、称取10kU果糖氨基酸氧化酶和200kU过氧化物酶，加入到步骤(三)得到的溶液中，充分搅拌使其完全溶解； (五)、最后用纯化水将步骤(四)得到的溶液中定容至1000ml，用0.2 μ ym滤器过滤，得到GA试剂2。
3.糖化白蛋白酶法检测试剂盒的检测方法，其特征在于:包括如下步骤: . 1、将6μ I样本和240 μ I的GA试剂I混匀，37°C孵育5分钟； .2、在546/700nm波长下测定吸光度Al，其中主波长为546nm，副波长为700nm； .3、加60μ I的GA试剂2混匀，37°C孵育5分钟； . 4、在546/700nm波长下测定吸光度A2，计算ΛΑ= A1-A2 ； .5、使用校准品(标准血清)，选用与校准品对应的质控品，质控测定值应在规定的范围内，采用以下公式计算:
Δ A样本 糖化A蛋 ? (GA)浓度=-------------X校准液浓度。
A A校准
【文档编号】C12Q1/37GK104164473SQ201310180869
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2013年5月16日
【发明者】鄢盛恺, 沈林 申请人:北京豪迈生物工程有限公司