抗人sST2单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗人sST2单克隆抗体及其应用。本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇表达系统中，制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白，用该蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体，从而用于对相关疾病的诊断或检测。
【专利说明】抗人sST2单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及抗人sST2单克隆抗体 及其应用。
【背景技术】
[0002] ST2(IL1RL1，DER4，T1和FIT-1)是Toll样/白介素受体超家族的一员，属于IL-1 受体亚家族。在人体内ST2基因编码3种亚型的蛋白质：分泌到细胞外的可溶型蛋白sST2， 膜结合型受体蛋白ST2L和主要在人肠组织中表达的ST2V[1]。ST2L由细胞膜外3个串联 的免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和细胞内的TIR(Toll/Interleukin-lreceptor)结构域 3部分组成[2]。ST2L广泛表达于多种造血细胞和非造血细胞[3]，在造血细胞中，ST2L 选择性的的表达在Th2淋巴细胞表面，而不表达在Thl淋巴细胞表面，因此ST2L可以作为 Th2细胞表面标记分子[4]。ST2L可以与胞外配体分子白介素-33(IL-33)及细胞膜上的 白介素-1受体辅助蛋白（IL-lRAcP)形成复合物，招募接头分子Myd88,激活细胞内多条信 号通路，促进Th2相关的炎症因子的表达[5,6]。IL-33/ST2L/IL-lRAcP信号通路在体内衔 接先天性免疫和适应性免疫进程，参与多种免疫相关疾病的调控过程，具体包括抗感染免 疫，肝炎，过敏及哮喘，自身免疫病，抗肿瘤免疫，中枢神经系统炎症，糖尿病,心血管疾病等 [7-10]。因此IL-33/ST2L信号通路可以作为多种疾病的潜在治疗靶点，在疾病治疗和诊断 中具有重要价值。
[0003] sST2为分泌性的可溶型蛋白，缺少ST2L的跨膜结构域和胞内结构域，在C段与 ST2L相比，存在9个不同的氨基酸片段[11]。sST2可作为诱骗受体，在细胞外与游离的 IL-33结合，抑制IL-33/ST2L/IL-lRAcP复合物的形成，起到负调控作用，抑制Th2相关的炎 症因子IL-4, IL-5, IL-13等的表达[12]。正常人体内，血清sST2浓度维持在非常低的水平， 但是在病毒感染[13]、自身免疫性疾病[14]、哮喘[15]、肺纤维化[16]、心衰[17]、呼吸衰 竭[18]、糖尿病[19]等多种病人体内，血清sST2水平明显升高。2004年，Shimpo，M.et al 等发现血清sST2水平可作为心衰标志物，预测心衰病人的死亡率，具有极其重要的预后诊 断价值[20]，随后的多项研究证明（[7]TablelStudies examining sST2in serum/plasma of patients with CV disease), sST2可以作为一种新型的心衰标志物，可用于预测急性 心肌梗死[20]，急性呼吸衰竭[18, 21]、非稳定的心力衰竭[22]，代偿性心力衰竭[23]，慢 性心力衰竭和左心室收缩功能不全[24]等多种心血管相关疾病的死亡率。而且sST2与现 有的心衰标志物CRP，BNP，ANP等具有功能互补作用，可以显著提高疾病预测的准确性[25， 26]。因此sST2, IL-33及相关抗体等具有极其重要的临床应用价值[2, 27]。
[0004] 获取特异性的抗人SST2的单克隆抗体，不仅可以应用于科学研究，还可以用于临 床诊断及治疗，具有极其巨大的应用前景，也越来越受到国际研究同行的重视。目前市面上 现有的检测sST2的抗体主要来自R&D，MBL，Santa Cruz，Abcam，sinobiological等公司，使 用的抗原来源于大肠杆菌表达或者哺乳动物细胞如293等的表达。由于sST2是一个高度 糖基化的蛋白，在大肠杆菌中缺乏糖基化修饰，因此使用大肠杆菌表达的重组蛋白在蛋白 活性和构象上与天然蛋白具有极大的差异；使用哺乳动物细胞如293等表达的重组人sST2 蛋白，虽然具有与人相似或者相同的糖基化修饰系统，但存在成本高产量低等缺陷。为了解 决上述问题，本发明人采用昆虫细胞（果蝇S2细胞），筛选得到了稳定表达重组人sST2蛋 白的细胞株，所得到的重组蛋白不仅具有与人的sST2蛋白相似的天然构象和活性，也具有 与哺乳动物表达系统类似的糖基化修饰。不仅避免了大肠杆菌表达系统中没有糖基化修饰 的缺陷，也弥补了哺乳动物细胞表达重组蛋白成本高产量低的劣势，具有极大的新颖性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供高效表达和纯化人sST2蛋白的方法；以及抗人sST2蛋白 的单克隆抗体及其应用。
[0006] 在本发明的第一方面，提供一种制备人sST2蛋白的方法，包括以下步骤：
[0007] (a)将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了人sST2基因序 列的表达载体；所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体；
[0008] (b)使（a)获得的插入了人sST2基因序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的 宿主细胞；所述的宿主细胞是果蝇S2细胞；
[0009] (c)培养转化的宿主细胞，从而表达出人sST2蛋白；
[0010] (d)分离获得人sST2蛋白。
[0011] 在一个优选例中，所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。
[0012] 在另一优选例中，在步骤（d)中，还包括用5±2μΜ CdCl2诱导表达。
[0013] 在本发明的另一方面，提供一种通过所述的方法制备的人sST2蛋白。
[0014] 在本发明的另一方面，提供一种单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性地抗所述 的人sST2蛋白。
[0015] 在一个优选例中，所述的单克隆抗体的亚型为IgG，κ。
[0016] 在另一优选例中，所述单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞株产生：8D9,7C11， 11E2,9B3 或 1A11。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法，所述的方 法包括步骤：培养杂交瘤细胞809、7(：11、1巧2、983或认11，使用上述杂交瘤细胞制备腹水， 以及从腹水中分离纯化上述细胞分泌的单克隆抗体。
[0018] 在本发明的另一方面，提供抗人SST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自： 8D9,7C11，11E2,9B3 或 1A11。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，含有前面所述的抗体。
[0020] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1、采用PCR扩增人SST2蛋白编码序列的电泳结果。
[0022] 各泳道样品依次为：1，2, 3 :人sST2蛋白编码序列，Marker :DL2, 000DNA Marker(Takara)，
[0023] 图2、插入人sST2蛋白编码序列的表达载体菌液PCR鉴定的电泳结果。
[0024] 图3、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白的SDS-PAGE图。
[0025] 各泳道样品依次为：泳道1 :hsST2蛋白纯化后使用Amicon Ultra_4Centrifugal Filter(30KD)浓缩后样品；泳道2 :PageRuler Prestained Protein Ladder (10_170kDa); 泳道3 :HisCiraviTrap?亲和层析柱纯化处理的穿透液；泳道4 :使用Washing Buffer清洗 的流穿液；泳道5-7 :洗脱液（每管收集lml样品）
[0026] 图4、使用亲和层析方法纯化重组人sST2蛋白免疫印迹（WB)分析结果。所用 抗体为 His_Tag(2A8) Mouse mAb(Abmart),二抗使用抗体为 Anti-Mouse IgG(H+L), AP Conjugate(Promega， S3721)
[0027] 各泳道样品上样顺序与图3相同。
[0028] 图5、Balb/c小鼠第二次免疫后血清抗体效价图，使用间接ELISA方法测定。从结 果可以显示经过两次免疫后4只小鼠血清抗体效价都超过1:32000。
[0029] 图6、为使用ProteinG亲和层析柱纯化腹水中抗体SDS-PAGE分析图。
[0030] 各泳道样品依次为：泳道1 :经结合缓冲液稀释处理后的腹水；泳道2 :HiTrap PtoteinG HP亲和层析柱处理后的穿透液；泳道3 :经结合缓冲液清洗柱子后的流穿液；泳 道4-7 :经洗脱缓冲液处理后的洗脱液。左图为使用浓度为7. 5%的SDS-PAGE进行非还原 性电泳结果；右图为使用浓度为10%的SDS-PAGE进行还原性电泳结果。从电泳结果可以看 到纯化的抗体条带单一，没有其它的杂带。
[0031] 图7、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行免疫印迹 分析结果及分析灵敏度的定量比较。
[0032] 左图显示分别使用杂交瘤细胞株8D9,7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的 抗体与R&D公司的商业化抗体MAB523检测1 μ g重组人sST2蛋白结果，右图显示杂交瘤细 胞株8D9, 7C11与R&D公司的商业化抗体MAB523检测一系列浓度梯度的重组人sST2蛋白 的检测结果。
[0033] 经过定量WB分析，可以发现在本实施例中使用相同浓度的抗体检测相同量的重 组人sST2蛋白时，经杂交瘤细胞株8D9和7C11分泌纯化的抗体比R&D公司的商业化抗体 MAB523具有更加灵敏的检测效果。
[0034] 图8、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行免疫沉淀 分析结果。
[0035] 分别使用杂交瘤细胞株8D9，7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的抗体与 R&D公司的商业化抗体MAB523,对果蝇S2细胞稳转细胞株无血清培养液（Serum free medium)和含有10%FBS培养液经CdCl2诱导72h后收集样品进行免疫沉淀分析。检测过程 中使用的一抗为 His_Tag(2A8)Mouse mAb (Abmart)，二抗为 IRDye800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)抗体。
[0036] 从分析结果可以看出上述抗体均可以结合培养液中游离的重组人sST2蛋白。
[0037] 图9、使用本发明中的单克隆抗体和R&D公司的商业化抗体MAB523进行流式细胞 术分析结果。
[0038] 分别使用杂交瘤细胞株8D9，7C11，9B3, 11E2，1A11，7F9，1A1分泌纯化的抗体与 R&D公司的商业化抗体MAB523对人的PBL细胞进行染色分析。
[0039] 从分析结果可以看出，杂交瘤细胞株7C11分泌纯化的抗体比R&D公司的商业化抗 体MAB523具有更好的分析效果，在相同的细胞群中更多表达ST2L的细胞被染色标记。
[0040] 图10、使用本发明中提供的双夹心酶联免疫法分析纯化的SST2重组蛋白和来源 于商业化试剂盒中的sST2蛋白标准品的标准曲线。
[0041] 分别使用抗体8D9,7C11，9B3作为包被抗体，生物素标记的抗体11E2和1A11作为 检测抗体进行双夹心ELISA分析。
【具体实施方式】
[0042] 本发明人经过广泛的研究，发现通过基因工程手段，将编码人sST2蛋白的基因重 组插入诱导分泌型表达载体pMT-BIP-V5/His A，将表达载体和筛选载体（pCoBlast)共同 转染果蝇S2细胞，通过有限稀释法可筛选得到稳定表达人sST2重组蛋白的稳转细胞株，分 离纯化可获取高纯度的人sST2重组蛋白，该蛋白具有与人的sST2蛋白类似的糖基化修饰 和天然构象。利用果蝇S2细胞表达纯化的人sST2蛋白作为抗原，可以获得特异性的识别 人sST2的高亲和力单克隆抗体，可以应用于WB，IP，FACS和ELISA分析。与R&D公司的商 业化抗体MAB523相比，本发明的抗体应用于WB和FACS分析时，具有更好的分析效果，在临 床诊断或治疗中具有重要的应用前景。
[0043] 本发明人第一次采用基因工程手段将编码人sST2蛋白的基因导入到适当的果蝇 表达系统中，制备出一种在活性上与天然的人sST2蛋白非常接近的重组人sST2蛋白，用该 蛋白免疫动物可获得灵敏地识别人体中天然的sST2蛋白的抗体，从而用于对相关疾病的 诊断或检测。
[0044] 本发明的提供一种使用果蝇S2细胞高效表达和快速纯化人sST2蛋白的方法，所 述方法包括以下步骤：
[0045] (a) PCR扩增得到编码人sST2蛋白编码序列
[0046] (b)将（a)所述的人sST2蛋白编码序列插入到果蝇S2细胞表达系统使用表达载 体的多克隆位点，获得了插入人sST2蛋白编码序列的表达载体。
[0047] (c)使用（b)获得的插入人sST2蛋白编码序列的表达载体和筛选载体一起，利用 磷酸钙转染方法共同转染S2细胞。
[0048] (d)使用抗生素筛选转染细胞，得到稳定转染筛选载体或筛选载体与表达载体共 转染的稳定细胞株。
[0049] (e)使用有限稀释技术结合Western blot分析方法，筛选筛选载体与表达载体共 转染的稳转单克隆细胞株。
[0050] (f)扩大培养（e)中获取的稳转单克隆细胞细胞株，加入诱导剂CdCl2诱导重组人 sST2蛋白表达。
[0051] (g)分离纯化获取人sST2重组蛋白。
[0052] 在本发明的一个优选实施例中，使用的表达载体为诱导分泌型表达载体 pMT-BiP-V5/His A，使用的筛选载体为pCoBlast，表达载体与筛选载体共转时比例为19:1.
[0053] 在本发明的一个优选实施例中，使用的诱导剂CdCl2浓度为5 μ M。
[0054] 在本发明的一个优选实施例中，洗脱缓冲液中使用的咪唑浓度为250mM
[0055] 本发明提供一种使用（g)中纯化的人sST2重组蛋白作为抗原，制备抗人sST2蛋 白的的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0056] (a)免疫动物
[0057] (b)杂交瘤细胞株制备和筛选
[0058] (c)抗体亚型鉴定
[0059] (d)腹水制备和抗体纯化
[0060] 在本发明的一个优选实施例中，抗体亚型鉴定用杂交瘤细胞培养上清液稀释比例 为 1:50
[0061] 本发明提供一种抗人sST2蛋白的抗体，其特征在于所述抗体为IgG类，κ亚型。
[0062] 在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体由8D9和7C11杂交瘤细胞株产 生。
[0063] 在本发明的一个优选实施例中，所述单克隆抗体由7C11杂交瘤细胞株产生。
[0064] 本发明提供一种免疫偶联物，其特点在于该免疫偶联物含有：
[0065] (a)本发明的单克隆抗体或人sST2重组蛋白；和
[0066] (b)选自下组的偶联物部分：药物，毒素，细胞因子，酶，生物素或放射性核素。
[0067] 本发明提供一种夹心酶联免疫方法，可以定量检测血清，组织液及细胞培养液中 的sST2浓度，其含有本发明的人sST2重组蛋白，单克隆抗体或免疫偶联物，或所述抗体或 免疫偶联物的组合。
[0068] 在本发明的一个优选实施例中，所述包被抗体由8D9、7C11或9B3杂交瘤细胞株分 泌。
[0069] 在本发明的一个优选实施例中，所述抗体免疫偶联物含有由11E2或1A11杂交瘤 细胞株分泌的抗体。
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0071] 实施例1、人SST2蛋白编码基因的获取
[0072] 通过检索GenBank数据库，查找得到关于人sST2基因的基本信息：NCBI Reference Sequence:NM_003856. 2, ORF Size:987nt Protein_id=//NP_003847. 2, 328aa〇 人sST2基因具有SEQIDN0:l所示的核苷酸序列，编码SEQIDN0:2所示的蛋白。
[0073] 从北京义翘神州生物技术有限公司购买包含有此基因 ORF的T载体（Human IL1R4 ORF，Catalog Number :HG10105-M)以此T载体为模板，设计特异性引物，在目的片段两端分 别引入两个酶切位点：Kpn I和ApaL I，通过PCR方法将sST2cDNA序列插入到果蝇S2表达 系统（Drosophial Expression System,周保罗研究员惠赠，购自Invitrogen公司）使用的 表达载体pMT/BiP/V5-His A(周保罗研究员惠赠，购自Invitrogen公司）中，使用引物序 列如下：
[0074] Forward Primer ：5, -CCGGGTACCTGGGTTTTGGATCTTAGC-3' (SEQ ID N0:3)
[0075] Reverse Primer ：5, ~CGCGGGCCCGAAACACTCCTTAC~3' (SEQ ID NO:4)
[0076] 注：下划线分别表示Κρη I和ApaL I酶切位点
[0077] 参照《分子克隆实验指南》方法使用上述特异性引物对人sST2cDNA进行扩增：
[0078] PCR 体系：50μ1
[0079] 5x Phusion? HF Buffer 10μ1 10 mM dNTPs ?μ? 50 mM MgC：l2 1 μ? Forward Primer 1 μ I Reverse Primer 1 μ? Phusion DNA 聚合嚼 0.5μ1 ddH20 34.5 μ! 模板 Ιμ?
[0080] PCR 程序：
[0081]
【权利要求】
1. 一种制备人SST2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤： (a) 将人sST2基因序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了人sST2基因序列的 表达载体；所述的表达载体是果蝇S2表达系统使用的诱导分泌型表达载体； (b) 使（a)获得的插入了人sST2基因序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主 细胞；所述的宿主细胞是果蝇S2细胞； (c) 培养转化的宿主细胞，从而表达出人sST2蛋白； (d) 分离获得人sST2蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His A载体。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（d)中，还包括用5±2yMCdCl2诱导 表达。
4. 一种通过权利要求1所述的方法制备的人sST2蛋白。
5. -种单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性地抗权利要求4所述的人 sST2蛋白。
6. 如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的亚型为IgG，κ。
7. 如权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由选自下组的杂交 瘤细胞株产生：8D9,7C11，11E2,9B3 或 1A11。
8. -种制备抗人sST2蛋白单克隆抗体的方法，所述的方法包括步骤：培养杂交瘤细胞 809、7(：11、1巧2、983或认11，使用上述杂交瘤细胞制备腹水，以及从腹水中分离纯化上述 细胞分泌的单克隆抗体。
9. 抗人sST2特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其选自：8D9,7C11，11E2,9B3*1A11。
10. -种试剂盒，其特征在于，含有权利要求5-7任一所述的抗体。
【文档编号】C12R1/91GK104151416SQ201310180447
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】蓝柯, 何志祥, 李康, 张弛宇, 崔盟, 马新蕾, 朱寅霜 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所, 重庆凯联投资有限公司