用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。本发明提供的引物组合物，包括DNA片段-Ⅰ、DNA片段-Ⅱ、DNA片段-Ⅲ和DNA片段-Ⅳ；所述DNA片段-Ⅰ包括序列表的序列1所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅱ包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅲ包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段-Ⅳ包括序列表的序列4所示的核苷酸序列。本发明的专用引物适用于对森林脑炎病毒进行特异性检测和定量分析。本发明的优点：（1）只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；（2）特异性高；（3）快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成；（4）灵敏度高；（5）鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。
【专利说明】用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。
【背景技术】
[0002] 森林脑炎（Forest encephalitis)又名蝶传脑炎（Tick-borne encephalitis, TBE)是由森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV)所致的一 种的以侵袭中枢神经统为主的自然疫源性急性传染病。1936年，Tkachev首次从患者分离 到该病毒。1937年，证实蜱为该病毒的传播媒介。我国于1942年首次发现该病，1952年从 患者及蜱中分别分离到森林脑炎病毒。近些年来我国森林脑炎有上升趋势，并呈现了新的 流行特性。
[0003] 森林脑炎传统临床诊断主要依赖于患者血清中特异IgM抗体的检测，以及利用普 通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核酸。这些方法需时长且需要特定的仪器， 难以满足临床快速诊断的需要。
[0004] 环介导等温扩增法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)法具有在 等温条件下即可高速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。该方法利用4条特异引物（F3、 FIP、B3和BIP)在高活性链置换DNA聚合酶作用下，不断复制扩增核酸。在反应体系中可 添加2条环状引物LF和LB，它们也分别与茎环结构结合启动链置换合成，周而复始。扩增 的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于鉴定森林脑炎病毒的引物组合物以及它们的应用。
[0006] 本发明提供的第一组引物组合物（引物组合物甲），包括DNA片段-I、DNA片 段_ II、DNA片段-III和DNA片段-IV ;所述DNA片段-I、所述DNA片段-II、所述DNA片 段-III和所述DNA片段-IV均为单链DNA片段；所述DNA片段-I包括序列表的序列1所 示的核苷酸序列，所述DNA片段-II包括序列表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片 段-III包括序列表的序列3所示的核苷酸序列，所述DNA片段-IV包括序列表的序列4所 示的核苷酸序列。
[0007] 所述引物组合物甲还可包括DNA片段-V和/或DNA片段-VI ;所述DNA片段-V 和所述DNA片段-VI均为单链DNA片段；所述DNA片段-V包括序列表的序列5所示的核 苷酸序列，所述DNA片段-VI包括序列表的序列6所示的核苷酸序列。
[0008] 所述引物组合物甲具体可由所述DNA片段-I、所述DNA片段-II、所述DNA片 段 _ III、所述DNA片段-IV、DNA片段-V和DNA片段-VI组成。
[0009] 所述DNA片段-I具体可如序列表的序列1所示，所述DNA片段-II具体可如序 列表的序列2所示，所述DNA片段-III具体可如序列表的序列3所示，所述DNA片段-IV具 体可如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V具体可如序列表的序列5所示，所述DNA片 段-VI具体可如序列表的序列6所示。
[0010] 本发明提供的第二种引物组合物（引物组合物乙)，包括DNA片段-W、DNA片 段-VILDNA片段-IX和DNA片段-X ;所述DNA片段-W、所述DNA片段-W、所述DNA片 段-IX和所述DNA片段-X均为单链DNA片段；所述DNA片段-W包括序列表的序列1所 示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-W包括序列表的序列2所示的核苷酸序 列的反向互补序列，所述DNA片段-IX包括序列表的序列3所示的核苷酸序列的反向互补 序列，所述DNA片段-X包括序列表的序列4所示的核苷酸序列的反向互补序列。
[0011] 所述引物组合物乙还可包括DNA片段-XI和/或DNA片段-ΧΠ ;所述DNA片段-XI 和所述DNA片段-ΧΠ 均为单链DNA片段；所述DNA片段-XI包括序列表的序列5所示的核 苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-ΧΠ 包括序列表的序列6所示的核苷酸序列的反 向互补序列。
[0012] 所述引物组合物乙具体可由所述DNA片段-W、所述DNA片段-W、所述DNA片 段-IX、所述DNA片段-X、所述DNA片段-XI和所述DNA片段-ΧΠ 组成。
[0013] 所述DNA片段-W具体可如序列表的序列1的反向互补序列所示，所述DNA片 段-W具体可如序列表的序列2的反向互补序列所示，所述DNA片段-IX具体可如序列表的 序列3的反向互补序列所示，所述DNA片段-X具体可如序列表的序列4的反向互补序列 所示，所述DNA片段-XI具体可如序列表的序列5的反向互补序列所示，所述DNA片段-ΧΠ 具体可如序列表的序列6的反向互补序列所示。
[0014] 本发明还保护以上任一所述引物组合物在辅助鉴定森林脑炎病毒中的应用。
[0015] 本发明还保护一种辅助鉴定森林脑炎病毒的方法，包括如下步骤：
[0016] (1)提取待测病毒的RNA ;
[0017] (2)以步骤（1)得到的RNA为模板，用以上任一所述的引物组合物进行反转录环介 导等温扩增；
[0018] (3)通过检测步骤（2) De扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为森林脑炎病毒。
[0019] 所述反转录环介导等温扩增的反应条件可为：60?65°C反应30?60min,然 后75°C 2min终止反应。所述反转录环介导等温扩增的反应条件具体可为：63°C反应 35-60min，然后75°C 2min终止反应。所述环介导等温扩增反应体系中，F3和B3的浓度均 为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L，LB和LF的浓度均为20pmol/L。
[0020] RNA提取可采用常规方法，如使用Qiagen RNeasy Mini kit或其他同类试剂盒。
[0021] 可在反转录环介导等温扩增的过程中通过实时浊度仪进行结果判断，如果观察到 典型的扩增曲线，待测样本为候选的森林脑炎病毒，如果没有观察到典型的扩增曲线，待测 样本为候选的非森林脑炎病毒。判断原理如下：核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷 酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg 2+ (或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉 淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸 大量合成，从而判断模板是否为靶序列，因此可以采用实时浊度仪及其配套程序软件实时 检测反应液的浊度变化。
[0022] 可通过荧光染料的颜色变化进行结果判断。应用本方法进行判定时，LAMP体系 中需要有钙黄绿素、Mg 2+和Mn2+。判断原理如下：反应初始时钙黄绿素与Mg2+结合，反应液 显示透明的橙色，核酸大量合成时，会生成副产物焦磷酸根，焦磷酸根离子的存在，使得Mg 2+ 游离出来，钙黄绿素和Mn2+结合，反应液显示微浊的黄绿色。基于该原理，可以根据反应液 的颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。自然光下，如果反应液 由透明橙色变为微浊的黄绿色，则表明待测样本为候选的森林脑炎病毒。紫外光下，如果反 应液显不强突光则表明待测样本为候选的森林脑炎病毒。
[0023] 本发明还保护以上任一所述的引物组合物在制备辅助鉴定森林脑炎病毒的试剂 盒中的应用。
[0024] 本发明还保护一种辅助鉴定森林脑炎病毒的试剂盒，包括以上任一所述的引物组 合物。
[0025] 本发明适用于对森林脑炎病毒进行特异性检测和定量分析。本发明的优点：（1) 只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；（2)特异性高；（3)快速高效，扩增反应在 60分钟内即可完成(如用6条引物仅需35分钟）；（4)灵敏度高；（5)鉴定方便简单。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为实施例2中，终止反应后，自然光下试管的照片。
[0027] 图2为实施例2中，终止反应后紫外灯照射下试管的照片。
[0028] 图3为实施例2的步骤四中，实时浊度仪的扩增曲线。
[0029] 图4为实施例2的步骤五中，实时浊度仪的扩增曲线。
[0030] 图5为实施例3中，终止反应后，自然光下试管的照片。
[0031] 图6为实施例3中，终止反应后紫外灯照射下试管的照片。
[0032] 图7为实施例3中，实时浊度仪的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0033] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
[0034] 反转录环介导等温扩增试剂盒（RT-LAMP试剂盒）：RNA Amplification Kit (RT-LAMP)，日本荣研公司，CodeNo :LMP244。LAMP 荧光检测试剂 fluorescent Detection Reagent，日本荣研公司，CodeNo:LMP221。RNA 提取试剂盒：RNeasy Mini Kit， QIAgen 公司产品，Cat No. 74014。RNA 酶抑制剂（Ribonuclease inhibitor):大连宝生物 (TAKARA)公司产品，CatNo. D2310。LA-320C实时浊度仪，日本荣研公司产品。
[0035] 提及东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的文献：何竞，常国辉，吴劲松，等.东部 马脑炎病毒E2基因的克隆与表达.军事医学科学院院刊.2002. 26 (2) :105。
[0036] 提及黄热病毒（yellow fever virus)的文献：Deng Y-Q, Dai J-X, Ji G-H, et al. (2011)A Broadly Flavivirus Cross-Neutralizing Monoclonal Antibody that Recognizes a Novel Epitope within the Fusion Loop of E Protein. PLoS 0NE6(1):el6059. doi:10. 1371/journal. pone. 0016059。
[0037] 提及森林脑炎病毒、日本乙型脑炎病毒、登革热病毒和西尼罗病毒的文献：范丽， 李裕昌，康晓平，等.Luminex液相芯片技术检测6种虫媒病毒方法的建立.解放军医学杂 志· 2012,37 (9) :459-463.。
[0038] 森林脑炎病毒、登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、东部马脑 炎病毒和西部马脑炎病毒，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所保证可在 符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后向公众提供。
[0039] 实施例1、引物组合物的设计和制备
[0040] 根据森林脑炎病毒设计的特异性引物的序列如下：
[0041] F3 (序列表的序列 1) :5' -GGATGTGTGGCTTGATTCCA-3' ；
[0042] B3 (序列表的序列 2) :5' -CGCAGTGATTACCCCAGCC-3' ；
[0043] FIP (序列表的序列 3) :5' -CATCTGGCCGCAACTTTGGTGTTTTTGGCCAAAACACGCGAGT A-3,；
[0044] BIP (序列表的序列 4) :5' -AATGGGGCCCGCCACTTTAG-CGGTCACTCTGGTCTCTCT-3' ；
[0045] LF (序列表的序列 5) :5' -CCGATAGCTTGGCATGCAGACAG-3' ；
[0046] LB (序列表的序列 6) :5' -AGAGTGGCACGGTGTGCA-3'。
[0047] 实施例2、引物组合物的灵敏度
[0048] 一、病毒样本的制备
[0049] 使用DMEM培养基将森林脑炎病毒的病毒液进行梯度稀释，得到8种不同浓度的 森林脑炎病毒液(森林脑炎浓度分别为1 X 1 〇3PFU/ml、1 X 102PFU/ml、1 OPFU/ml、lPFU/ml、 0· lPFU/ml、0. 01PFU/ml、0. OOlPFU/ml 和 0· 0001PFU/ml)。
[0050] 样本1 :浓度为1 X 103PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0051] 样本2 :浓度为1 X 102PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0052] 样本3 :浓度为10PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0053] 样本4 :浓度为lPFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0054] 样本5 :浓度为0· lPFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0055] 样本6 :浓度为0. 01PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0056] 样本7 :浓度为0· 001PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0057] 样本8 :浓度为0· 0001PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0058] 二、提取病毒的总RNA
[0059] 采用RNA提取试剂盒并按试剂盒说明书提取210微升待测样本液(分别将步骤一 制备的样本1至样本8作为待测样本液）的总RNA，具体方法如下：
[0060] 将210 μ 1待测样本液加入1. 5ml离心管中，补加700 μ 1 RLT溶液(试剂盒组分） 和7 μ 1 β -巯基乙醇，振荡混匀后加入490 μ 1无水乙醇，剧烈振荡后分两次加至硅胶柱 (试剂盒组分）中，进行硅胶柱过滤。
[0061] 将加样后的硅胶柱l〇〇〇〇g离心15s，然后加入700 μ 1 RW1缓冲液(试剂盒组分)， 10000g离心15s，然后用RPE缓冲液(试剂盒组分）离心洗硅胶柱两次(每次500 μ 1);将硅 胶柱转至新的离心管中，l〇〇〇〇g离心2min ;将硅胶柱转至新的离心管中，加入50μ 1无核酸 酶水，室温静置2min，然后10000g离心2min，收集洗脱液；在洗脱液中加入1 μ 1 RNA酶抑 制剂，即为含有病毒总RNA的溶液，-80° C保存。
[0062] 三、应用专用引物检测森林脑炎病毒
[0063] 用实施例1设计的引物组合物检测步骤二得到的含有病毒总RNA的溶液，采 用RT-LAMP试剂盒并按试剂盒说明书在试管中进行反应。2XEnzyme Buffer、Enzyme和 Fluorecent Detection Reagent 均为试剂盒组分。
[0064] RT-LAMP反应体系（25 μ 1) :F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度 均为 40pmol/L，LB 和 LF 的浓度均为 20pmol/L，2XEnzyme Bufferl2. 5 μ 1 (含 Mg2+ 和 Mn2+)，Enzymel μ 1，Fluorecent Detection Reagentl μ 1 (含I丐黄绿素），2·5μ1 待测 RNA, 用无核酸酶和脱氧核酶的去离子水定容。
[0065] RT-LAMP反应体系在63°C反应60min，然后75°C、2min终止反应。
[0066] 终止反应后，自然光下试管的照片见图1，1至8依次代表样本1至样本8。终止反 应后紫外灯照射下试管的照片见图2,1至8依次代表样本1至样本8。图1中，样本1至样 本5为阳性，样本6至样本8为阴性。图2中，样本1至样本5为阳性，样本6至样本8为 阴性。
[0067] 结果表明，采用肉眼观察，灵敏度为0. lPFU/ml。待测RNA中病毒RNA的浓度= 0· lPFU/mlX210Xl(T3ml + 50y 1 ? 0.00004PFU/y 1。每个LAMP 反应体系中病毒 RNA 的含 量=0· 0004PFU/y 1X2. 5μ 1 ?0· 001PFU。即灵敏度为 0· 001PFU/ 反应体系。
[0068] 采用紫外灯照射下观察，检测方法的灵敏度为0. 001PFU/反应体系。
[0069] 四、用引物组合物检测森林脑炎病毒(实时浊度仪）
[0070] RT-LAMP反应体系中不含有Fluorecent Detection Reagent，其它同步骤三的 RT-LAMP反应体系。
[0071] 将RT-LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63°C反应60min，然后75°C、2min终 止反应。
[0072] 实时浊度仪扩增曲线见图3。样本1至样本5为阳性，样本6至样本8为阴性。
[0073] 浊度仪观察的灵敏度为0. 001PFU/反应体系。
[0074] 五、用引物组合物检测森林脑炎病毒(实时浊度仪）
[0075] RT-LAMP 反应体系中不含有 Fluorecent Detection Reagent、LB 和 LF，其它同步 骤三的RT-LAMP反应体系。
[0076] 将RT-LAMP反应体系置于LA320C实时浊度仪，63°C反应60min，然后75°C、2min终 止反应。
[0077] 实时浊度仪扩增曲线见图4。样本1至样本5为阳性，样本6至样本8为阴性。
[0078] 浊度仪观察的灵敏度为0. 001PFU/反应体系。
[0079] 实施例3、特异性检测
[0080] 使用DMEM培养基将待测病毒的病毒液进行稀释，得到浓度为1 X 105PFU/ml的病 毒液。待测病毒分别为森林脑炎病毒或与森林脑炎病毒具有相似症候的病毒(登革热病毒、 黄热病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒)。
[0081] 样本1 :浓度为1 X 105PFU/ml的登革病毒液。
[0082] 样本2 :浓度为1 X 105PFU/ml的黄热病毒液。
[0083] 样本3 :浓度为1 X 105PFU/ml的西尼罗病毒液。
[0084] 样本5 :浓度为lX105PFU/ml的日本乙型脑炎病毒液。
[0085] 样本6 :浓度为1 X 105PFU/ml的东部马脑炎病毒液。
[0086] 样本7 :浓度为1 X 105PFU/ml的西部马脑炎病毒液。
[0087] 样本8 :浓度为1 X 105PFU/ml的森林脑炎病毒液。
[0088] 检测方法同实施例3。
[0089] 终止反应后，自然光下试管的照片见图5,1至8依次代表样本1至样本8。终止反 应后紫外灯照射下试管的照片见图5,1至8依次代表样本1至样本8。实时浊度仪扩增曲 线见图7。
[0090] 登革热病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部 马脑炎病毒均为阴性结果。森林脑炎病毒为阳性结果。
[0091] 上述结果说明本发明提供的引物组合物具有良好特异性。
【权利要求】
1. 弓丨物组合物，包括DNA片段-I、DNA片段-II、DNA片段-III和DNA片段-IV ;所述 DNA片段-I、所述DNA片段-II、所述DNA片段-III和所述DNA片段-IV均为单链DNA片 段；所述DNA片段-I包括序列表的序列1所示的核苷酸序列，所述DNA片段-II包括序列 表的序列2所示的核苷酸序列，所述DNA片段-III包括序列表的序列3所示的核苷酸序列， 所述DNA片段-IV包括序列表的序列4所示的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物还包括DNA片段-V 和/或DNA片段-VI ;所述DNA片段-V和所述DNA片段-VI均为单链DNA片段；所述DNA 片段-V包括序列表的序列5所示的核苷酸序列，所述DNA片段-VI包括序列表的序列6 所示的核苷酸序列。
3. 如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物由所述DNA片 段_ I、所述DNA片段-II、所述DNA片段-III、所述DNA片段-IV、DNA片段-V和DNA片 段-VI组成。
4. 如权利要求3所述的引物组合物，其特征在于：所述DNA片段-I如序列表的序列 1所示，所述DNA片段-II如序列表的序列2所示，所述DNA片段-III如序列表的序列3所 示，所述DNA片段-IV如序列表的序列4所示，所述DNA片段-V如序列表的序列5所示， 所述DNA片段-VI如序列表的序列6所示。
5. 弓丨物组合物，包括DNA片段-W、DNA片段-W、DNA片段-K和DNA片段-X ;所 述DNA片段-W、所述DNA片段-W、所述DNA片段-IX和所述DNA片段-X均为单链DNA 片段；所述DNA片段-W包括序列表的序列1所示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA 片段-W包括序列表的序列2所示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-IX包括 序列表的序列3所示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-X包括序列表的序列 4所示的核苷酸序列的反向互补序列。
6. 如权利要求5所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物乙还包括DNA片 段-XI和/或DNA片段-ΧΠ ;所述DNA片段-XI和所述DNA片段-ΧΠ 均为单链DNA片段；所 述DNA片段-XI包括序列表的序列5所示的核苷酸序列的反向互补序列，所述DNA片段-ΧΠ 包括序列表的序列6所示的核苷酸序列的反向互补序列。
7. 权利要求1至6中任一所述的引物组合物在辅助鉴定森林脑炎病毒中的应用。
8. -种辅助鉴定森林脑炎病毒的方法，依次包括如下步骤： (1) 提取待测病毒的RNA ; (2) 以步骤（1)得到的RNA为模板，用权利要求1至6中任一所述的引物组合物进行反 转录环介导等温扩增； (3) 通过检测步骤（2)的扩增产物辅助鉴定待测病毒是否为森林脑炎病毒。
9. 权利要求1至6中任一所述的引物组合物在制备辅助鉴定森林脑炎病毒的试剂盒中 的应用。
10. -种辅助鉴定森林脑炎病毒的试剂盒，包括权利要求1至6中任一所述的引物组合 物。
【文档编号】C12Q1/70GK104152440SQ201310179807
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】秦成峰, 姜涛, 刘娟, 李晓峰, 邓永强, 秦鄂德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所