一种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种嗜热酯酶及其在降解PAEs（邻苯二甲酸酯）中的用途。该酯酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。在含水介质中，在该酯酶或其融合蛋白的催化下，邻苯二甲酸酯进行水解反应，形成邻苯二甲单酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。本发明的酯酶能够将塑化剂初步降解。该酶对中低浓度的变性剂和有机溶剂具有一定抗性，热稳定性优越，并且显示了对多种PAEs底物的降解功能，该酶是文献中报道的唯一一个从嗜热微生物中克隆得到的，其优良的性能使其在PAEs的纯酶法降解中有着良好的应用前景。本发明无害化降解PAEs，降解反应稳定性好，反应条件粗放，反应速度快。
【专利说明】-种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应 用。
【背景技术】
[0002] 各种各样的化学合成物质在人类的生活中起着至关重要的作用，它们改善了人们 的生活，推动了人类社会文明的发展。但同时它们也污染了我们的地球，给我们的生存环境 带来了极大的压力。还有一些化合物，它们对于环境的危害是经过多年的科学实验才验证 的，此时，其在自然界中的蓄积范围和蓄积量已经达到了严重的地步。邻苯二甲酸酯（PAEs) 类又称酞酸酯类，是大约30种化合物的总称，在生活中广泛使用，主要作为塑料制品的塑 化剂，它在很低浓度时即具有生殖毒性，且它进入环境后，不易迅速降解，可在环境中蓄积 和通过生物链富集，PAEs已成为全球最普遍的污染物之一。
[0003] 目前一致认为，PAEs降解最有效的途径是微生物介导的生物降解，围绕PAEs的生 物降解性研究主要应集中在三个方面：一是研究不同生物的降解代谢途径，二是分子机制 的研究，关注负责催化反应的酶系、相关基因或操纵子结构。三是筛选适合和驯化的特异菌 种及适宜的生物酶。
[0004] 酯水解酶在PAEs的无害化降解中起着重要的作用，有一些具有初步催化功能的 微生物被分离出来，但负责相关反应的酶却仅有数个得到表征。这些酶都是从生态环境单 一的中温微生物中分离得到的，稳定性差，实际应用价值不大。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种邻苯二甲酸酯的生物酶降解法，该方法 可以快速降解邻苯二甲酸酯，并且反应条件粗放，可以在高温下进行，在酶变性剂、有机溶 齐U、金属离子等污染物的存在下，邻苯二甲酸酯还是可以快速的彻底降解。
[0006] 本发明人发现了一种可以快速彻底降解邻苯二甲酸酯的酯酶，并且该酯酶热稳定 性高，对酶变性剂、有机溶剂、金属离子耐受性好，催化活性高，从而可以将邻苯二甲酸酯快 速彻底降解成邻苯二甲酸和相应的醇。
[0007] 本发明的技术方案之一是：一种分离的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本发明的技术方案之二是：一种酯酶融合蛋白，其特征在于，所述的酯酶融合蛋白 是氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶添加一肽段后的融合蛋白，所述的肽段是表达亲 和层析标签His-tag。
[0009] 本发明的技术方案之三是：一种分离的编码所述的酯酶的核酸，其特征在于，其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本发明的技术方案之四是：一种包含所述的核酸的重组表达载体。
[0011] 本发明的技术方案之五是：一种重组表达转化体，其特征在于，该重组转化体包含 所述的重组表达载体。
[0012] 本发明的技术方案之六是：一种邻苯二甲酸酯的生物酶降解法，其特征在于，包括 以下步骤，在含水介质中，在氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶或其融合蛋白的催化 下，邻苯二甲酸酯进行水解反应，形成邻苯二甲单酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。
[0013] 本发明中，所述的酯酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。其是来源于嗜酸硫化 芽抱杆菌（Sulfobacillus acidophilus)的酯酶。
[0014] 本发明中，所述的酯酶可以从嗜酸硫化芽孢杆菌中分离获得，也可以从重组表达 该酯酶的表达子中分离获得，也可以人工合成获得。
[0015] 本发明中，较佳的，所述的酯酶由包括以下步骤的方法制备而得：培养含有编码氨 基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶的核酸的表达载体的大肠杆菌，从发酵液中得到重组 酯酶。
[0016] 本发明中，所述的编码编码氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示的酯酶的核酸可以从 嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中分离获得，也可以从含有该SEQ ID No. 2所示的核酸的重组载 体中或者重组表达转化提中分离获得，也可以全人工合成获得。
[0017] 本发明中，如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No. 2的氨 基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于嗜酸硫化芽孢杆菌基因组中相应的酯酶基因序列。本 发明的酯酶的编码核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的其他 任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同 系物。较佳的，所述的编码SEQ ID No. 2的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0018] 其中，所述的多聚核苷酸的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的 启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启 动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有 效的启动子完全替换，可提1?目标蛋白的表达水平。
[0019] 其中，所述的多聚核苷酸的同系物还指一种具有在标准条件下能够与嗜酸硫化 芽孢杆菌基因组中相应的酯酶基因序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷 酸。在标准条件下进行杂交可根据"分子克隆"中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分 子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为〇. lwt%SDS、5wt% 硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2?8XSSC。20XSSC为3M氯化钠和0. 3M的 柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50?70° C。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清 洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6XSSC+0. lwt%SDS溶液， 更优选为5XSSC+0. lwt% SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA 分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
[0020] 本发明所述的表达载体可通过本领域常规方法将本发明的编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶的核酸连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常 规的各种载体，如市售的质粒(大肠杆菌中合适载体有PLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、 pUC19、pKC30、pR印4、pHS 1、pHS2、pMBL等)、粘粒（pHZ 132 )、噬菌体或病毒载体(反转录病毒 载体，腺病毒载体）等所述质粒代表一小部分的可能质粒，其他质粒为技术人员公知。本发 明所述重组载体较佳地采用pET28a质粒。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达 载体：将上游引物：5 ' -GGAATTCCATATGCCACTTGATCCGCGGGTTGAAC-3 '，下游引物：5 ' -CCCAAG CTTTCATGGCTCTTCAAACCGGGTTCTTATA-3'，模板为嗜酸硫化芽孢杆菌基因组进行PCR扩增所 得的扩增产物和表达载体pET28a用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切，形成互补的 粘性末端，生成含有本发明的酯酶编码核酸片段的重组表达载体pET28a-10332。
[0021] 本发明中，所述的含有编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶的核酸的表达 载体的大肠杆菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主大肠杆菌中制得。所述的 大肠杆菌优选大肠埃希氏菌（E. coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌（E. coli)DH5a，更优选 (E. coli)BL21 (DE3)。将本发明前述重组表达载体pET28a-10332通过常规转化方法，转化 至E. coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即表达转化体BL21(DE3)/ pET28 - 10332〇
[0022] 其中，所述的表达转化体由常规方法培养，较佳的培养方法包括以下步骤：以1% 的接种量将表达转化体BL21 (DE3)/ρΕΤ28 - 10332接入LB发酵液中，37°C、200rpm下培养 至菌体0D6QQ达到0. 4?0. 6之间时加入终浓度为ImM的IPTG继续在25?37°C、160? 220rpm，诱导表达12h之后，S卩可。
[0023] 本发明由发酵液中获得表达产物--氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶。较 佳的将发酵液固液分离取湿菌体，破碎细胞后，取上清液，用表达序列标签亲和层析分离纯 化得到SEQ ID NO. 1所示的酯酶。
[0024] 本发明中，所述的融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶添加一肽段 后的融合蛋白，只要该融合蛋白还是具有酯酶活性即可。所述的添加的一肽段可以是本领 域常规的肽段，优选表达亲和层析标签(如His-tag)或者外分泌信号肽。所述的表达亲和 层析标签His-tag是本领域常规，较佳的是6个组氨酸。
[0025] 本发明中，所述的邻苯二甲酸酯是如式（I )所示的化合物。邻苯二甲酸酯在本 发明所述的酯酶的催化作用下水解，先形成如式（II)所示的邻苯二甲酸单酯，再形成如式 (ΠΙ)所示的邻苯二甲酸。
[0026]
【权利要求】
1. 一种分离的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -种酯酶融合蛋白，其特征在于，所述的酯酶融合蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示的酯酶添加一肽段后的融合蛋白，所述的肽段是表达亲和层析标签His-tag。
3. -种分离的编码权利要求1所述的酯酶的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。
5. -种重组表达转化体，其特征在于，该重组转化体包含如权利要求4所述的重组表 达载体。
6. -种邻苯二甲酸酯的生物酶降解法，其特征在于，包括以下步骤，在含水介质中，在 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的酯酶或其融合蛋白的催化下，邻苯二甲酸酯进行水解反 应，形成邻苯二甲单酸和醇，再形成邻苯二甲酸和醇。
7. 如权利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述的邻苯二甲酸酯是如式（I ) 所示的化合物，邻苯二甲单酸是如式（II)所示的化合物，邻苯二甲酸是如式(III)所示的化 合物，
其中，&和R2分别或同时代表C2-C10直链烷基。
8. 如权利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述含水介质为磷酸缓冲液、 Tris-HCl缓冲液、巴比妥钠缓冲液或者硼酸-硼砂缓冲液。
9. 如权利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述的含水介质还含有能够溶解 邻苯二甲酸酯的有机溶剂，所述的有机溶剂和含水介质的体积比为1:1000-1: 9。
10. 如权利要求6所述的生物酶降解法，其特征在于，所述水解反应的反应温度是 37-60°C，所述水解反应的反应时间是1分钟-24小时。
【文档编号】C12N15/63GK104152425SQ201310178873
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】范翔, 张晓彦, 李骋远, 邢帅, 许建和 申请人:华东理工大学