基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人感染甲型h7n9流感病毒基因的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院等用于对发热病人咽拭子等标本的人甲型H7N9流感病毒HA基因和NA基因的检测和监测。具体是应用基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过计算机软件分析人甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的保守序列，分别设计出六条引物完全与识别基因靶序列中八个结合区匹配，并于反应前加入HNB(羟基萘酚蓝)染料，只需一步就可完成在63℃等温环境中扩增1.5小时，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果，与传统的RT-PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。
【专利说明】基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人感染甲型 H7N9流感病毒基因 发明领域
[0001] 本发明是用基于HNB颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人感染甲型H7N9流 感病毒的H7基因和N9基因。用于各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院 对人感染甲型H7N9流感病毒的检测和监测。
[0002] 发明背景
[0003] H7N9流感病毒是一种新型的重组甲型流感病毒，其基因是来自于东亚地区野鸟和 中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配型。该病毒之前仅发现于鸟禽间，但是2013年3月底 在上海和安徽两地全球首次报道了人感染H7N9流感病毒病例。这种病毒的传播途径主要 经呼吸道传播，也可通过接触带病毒禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被 感染，但是目前还尚无人与人之间传播的确切证据。易感人群以与禽类养殖、销售、宰杀、力口 工以及在发病前1周内接触过禽类的成年人为主。截止2013年5月6日，全国（含台湾省） 已确诊甲型H7N9流感130例，31人死亡，42人痊愈。病例分布于北京、上海、江苏、浙江、安 徽、山东、河南、台湾、福建等地。鉴于我国甲型H7N9流感疫情不断扩大的局面，为有效阻止 疫情的更大范围传播和疫情及时应急处置，根据卫生部应对甲型H7N9流感疫情防控要求， 我国已决定在各地增加病毒检测实验室和哨点医院，扩大监测网络的覆盖范围。将网络实 验室扩大到整个地市一级，目标是使全国300多个地市都具备能够进行病毒检测的能力， 及早发现和确诊甲型H7N9病例，尤其严密监测其人传人流行性调查，切实有效地做到早发 现、早报告、早处置。本专利成功建立的基于颜色的RT-LAMP检测人甲型H7N9流感病毒基 因方法，将为提高我国流感监测网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快 速筛查提供了有力的技术保障。
[0004] 与传统基因分子诊断方法相比，基于颜色的RT-LAMP技术在RNA病毒检测方面有 着无法比拟的优势，尤其在可操作性和设备要求方面。这种优势的存在主要是因为RT-LAMP 技术如下几个方面的特点：第一，检测时间短灵敏度高。整个检测时间可缩短至1?1. 5小 时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。第二，特异性高。所设计的六条特异性引物，只 在其与识别靶序列中八个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进行，因此这很大程度上 减少了非特异性扩增反应的可能，从而使检测特异性更为可靠。第三，设备要求简单。扩增 反应在60?65°C恒温条件下进行，无核酸变复性过程，除了应用一些常用聚合酶外，对硬 件设备基本无特殊要求，普通级别下的生物实验室即可完成检测和结果判断。第四，污染机 会低。在实施过程中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的 质控工作。同时，该技术于反应前加入显色染料，避免了常规RT-LAMP的后续开盖行为，有 效地防止了气溶胶污染。第五，结果可视化。RT-LAMP扩增反应过程中可产生大量副产物焦 磷酸镁白色沉淀，或在扩增前加入一定量羟基萘酚蓝（HNB)，使得阳性反应管中出现可视的 白色混浊物或反应管内颜色变化，从而实现检测结果的直接可视化判定。
【发明内容】
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[0005] 1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵 敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，检测时间短灵敏度高。整个检测时间 可缩短至1?1.5小时内，灵敏度可与实时荧光定量PCR媲美。其次，特异性高。所设计 的六条特异性引物，只在其与识别靶序列中八个结合区完全匹配的情况下扩增才能顺利进 行。然后，所有的扩增过程都可在63°C等温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。 最后，污染机会低和结果可视化。。
[0006] 2.选择人感染甲型H7N9流感HA基因 （GISAID :EPI439507)的288?483位和NA 基因 （GISAID :EPI439509)的151?352位的相对保守区设计相应的RT-LAMP引物，针对每 个基因分别包括两条外引物（F3、B3)和两条内引物（FIP、BIP)，两条环结合引物（Loopl、 Loop2)。所有引物的具体序列见表1和表2。
[0007] 表1 :RT-LAMP检测人感染甲型H7N9流感H7基因的引物序列
[0008]
【权利要求】
1. 一种用于人感染甲型H7N9流感病毒HA基因和ΝΑ基因检测的基于HNB (羟基萘酚 蓝）颜色的环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP)，其中包括：用于人感染H7N9流感病毒 H7基因检测的6条寡核苷酸引物、N9基因检测的6条寡核苷酸引物和HNB (羟基萘酚蓝） 染料。
2. 权力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3. 权力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术 (RT-LAMP)包括人感染甲型H7N9流感病毒及其变异株。
4. 权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，流感检测网络实 验室，哨点医院用于人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因的检测和监测。
5. 权力要求1所述的人感染甲型H7N9流感病毒H7基因和N9基因检测的基于HNB颜 色的环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP)的反应程序和检测程序。
【文档编号】C12Q1/68GK104152577SQ201310178859
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】马学军, 舒跃龙, 聂凯, 王大燕, 丁雄 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所