一种干扰Survivin基因表达的siRNA分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种干扰Survivin基因表达的siRNA分子及其应用，所述siRNA分子包括正义链和反义链，其中正义链的核苷酸序列为5′-CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCCX-3′，反义链的核苷酸序列为5′-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACGX-3′，上述X代表tt、TT或UU，t代表脱氧胸腺嘧啶。其中，反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、降低肿瘤的细胞的耐药性、抑制肿瘤血管的生成，达到抑制肿瘤的目的。本发明所述的siRNA采用人工化学合成方法制备，可以用作抗肿瘤的药物。
【专利说明】—种干扰Survivin基因表达的s iRNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可干扰凋亡抑制因子survivin基因的小分子干扰RNA(SiRNA),及其抗肿瘤的用途。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要杀手之一，尽管各种的治疗方法不断出现，但目前还没有找到真正有效的根治方法，肿瘤的治疗一直是长期困扰医学界的世界性难题。逃避凋亡是所有肿瘤的特征，它使得肿瘤细胞在异常生长刺激下存活，并抵抗化疗和放疗。抗凋亡蛋白通过与凋亡信号作用成为新的最有潜能的治疗靶标来抑制肿瘤细胞的生长。
[0003]凋亡抑制基因survivin是1997年发现的一种重要的肿瘤相关基因，该基因是在人类基因组文库中筛选克隆到的，它定位于17q25，全长15KB，含4个外显子和3个内含子，基因编码产物为由142个氨基酸组成的蛋白，分子量16.2KD,具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。该基因具有两个突出的特点:(I)几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；
(2)具有抗肿瘤细胞凋亡、促进有丝分裂、调节细胞周期、参与血管形成和放化疗耐受多种功能于一体，是目前发现最强的凋亡抑制因子。Survivin功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用。现已发现，Survivin基因在胚胎组织及恶性肿瘤中普遍表达，如乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素癌、肠癌、神经母细胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的组织(除胎盘、增殖期子宫内膜、分泌期子宫内膜有微量表达外)及癌旁正常组织中无表达。它的这一特性，使得Survivin成为免疫治疗、基因治疗和小分子抗肿瘤药物开发的重要靶点。
[0004]RNA干扰(RNA interference,缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA(double-strtlnded RNA, dsRNA)诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，其原理是:以RNase III核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21_23nt及3’端突出的小干扰RNA (small interfering RNA, si RNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-1nduced silencing complex, RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
[0005] RNAi技术是上世纪末到本世纪初发展的一项崭新技术，该项技术的发现为疾病治疗尤其是癌症的治疗开辟了全新的途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗理念。用siRNA干扰特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。应用RNA干扰技术,用祀向至Survivin基因的siRNA作为祀向药物,在基因的转录后进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，对肿瘤进行抑制，在不久的将来可能成为一种新的肿瘤治疗方法。
【发明内容】
[0006]为抑制肿瘤细胞的增殖和转移，本发明公开了一种通过siRNA分子库技术筛选出的高效祀向Survivin基因的双链siRNA分子,其由下述正义链和反义链组成:
[0007]正义链5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCC UUCCX-3'，(SEQ ID NO:1)
[0008]反义链5' -GGAAGGCUGGGAGCCAGAU GACGX-3'，(SEQ ID NO:2)其中 X 代表 tt、TT或uu，t代表脱氧胸腺嘧啶。
[0009]换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为
[0010]正义链:5'-CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCC-3'
[0011]反义链:5'-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACG-3'，
[0012]在一个优选的实施方式中，上述序列中3'端的“X”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。
[0013]本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014]体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，达到治疗肿瘤的目的。本发明所述的siRNA采用人工化学合成方法制备，可以用作抗肿瘤的药物。
[0015]为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表不的意思和范围相同。
[0016]其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。
[0017]本发明的siRNA分子来源于针对Survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备的siRNA分子库。
[0018]siRNA的制备可采用多种方法，比如:化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以更好地获得基因沉默效率。
[0019]本发明的SiRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。肿瘤疾病包括肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤。
[0020]出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA表达框、或者包含siRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。表达所述siRNA的质粒还可以用于制备沉默Survivin基因的试剂盒。
[0021]本发明还公开了一种沉默细胞Survivin基因的方法，具体包括以下步骤:
[0022]I)将细胞按IXlO4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱细胞培养24小时；
[0023]2)用Opt1-MEM分别稀释RNA分子和Lipofectamine RNAiMAX,将两者混合，室温下孵育10-20分钟。
[0024]3)将第2)步所得的混合物加入第I)步培养细胞中，在37°C孵育24_48小时。
[0025]本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
[0026]任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是化学合成的siRNA转染U20S细胞后实时定量PCR检测Survivin mRNA表达量柱形图，纵坐标表示Survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示四个处理实验组，其中s-siRNA-Ι为本发明的siRNA转染实验组。
[0028]
【具体实施方式】
[0029]下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
[0030]实施例1:化学合成siRNA验证Survivin沉默效果
[0031]1.主要仪器、试剂和材料.
[0032]1.1仪器:核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司);实时定量PCR仪(B1-Rad)；细胞培养箱(Thermo)等。
[0033]1.2 材料和试剂:RNAiMAX?(invitrogen), DMEM 培养基(Gibco), TurboCapturemRNA kit (QIAGEN), SensiMix? one-Step Kit (Quantace)等。其他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
[0034]1.3PCR引物(百奥迈科生物技术有限公司合成):
[0035]Survivin 正向引物:5' -AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG-3'
[0036]Survivin 反向引物:5' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3'
[0037]GAPDH 正向引物；5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'
[0038]GAPDH 反向引物:5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'
[0039]2.化学合成制siRNA
[0040]根据survivin基因的核苷酸序列,设计小分子干扰s_siRNA_l:
[0041 ]正义链:5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCCUUCC dTdT-3'
[0042]反义链:5'-GGAAGGCUGGGAGCCAGAUGACG dTdT-3'
[0043]将该序列在人类EST数据库中比对，确定没有与它相同的其它基因序列。siRNA的合成利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)。同时也合成了文献(J Controlled release，146 (2010) 378-387 和 MolecularPharm，3 (5) 579-588)中报道的两种常用survivin siRNA作为正对照组,序列分别为:
[0044]s-siRNA-2:
[0045]正义链:5’-GGA CCA CCG CAU CUC UACA dTdT-3’ (SEQ ID NO:3)
[0046]反义链:5，-UGUAGA GAU GCG GUG ⑶CC dTdT-3’ (SEQ ID NO:4)
[0047]s-siRNA-3:
[0048]正义链:5，-GGCUGG CUU CAU CCA CUGC dTdT-3’ (SEQ ID NO:5)
[0049]反义链:5，-GCAGUG GAU GAA GCC AGCC dTdT-3’ (SEQ ID NO:6)
[0050]3.沉默效率验证
[0051]3.1细胞培养:癌细胞U20S和A549在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养。
[0052]3.2细胞铺板并转染:将细胞按IXlO4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%CO2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照RNAiMAX?的说明书转染，s-siRNA-Ι按50nM/孔加入。同时用转染试剂RNAiMAX?将两个正对照s-siRNA-2、s-siRNA-3 以及负对照 siRNA 转入 U20S 与 A549 细胞。
[0053]3.3实时定量PCR检测Survivin基因mRNA水平:用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA,操作按试剂盒说明书进行,用80 μ L无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。
[0054]用基因特异性引物检测样本中Survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系:4 μ L模板RNA，12.5 μ L2X SensiMix one-step, I μ L5 ;正向引物(6 μ Μ)，0.5 μ L50X SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ L。反应条件:40°C反转录30min，95°C预变性7min，95°C变性20sec，6(TC退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。
[0055]3.4结果分析:用实时定量PCR2_" "et法分析实验结果，并作出柱状图，如图1所示，结果显示祀向至Survivin基因的s_siRNA_l~3的沉默效果，本发明的设计的s-siRNA-Ι的沉默效果要明显优于文献中报道的s-siRNA-2和s-siRNA-3。
[0056]实施例2 =Survivn基因沉默对肿瘤细胞增殖的影响
[0057]1.材料及仪器
[0058]肺癌细胞A549 、骨肉瘤细胞U20S、乳腺癌细胞MDA-MB-231、DMEM培养基(Gibco)、MTT、细胞培养箱(Thermo)、酶联免疫监测仪。
[0059]2、方法
[0060]2.1细胞培养:肺癌细胞A549、骨肉瘤细胞U20和乳腺癌细胞MDA-MB-231在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养。
[0061]2.2细胞铺板并转染:将细胞按IXlO4/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%CO2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照RNAiMAX?的说明书转染，s-siRNA-Ι按50nM/孔加入。
[0062]2.348小时后观察细胞时相和细胞增殖情况。
[0063]3、实验结果
[0064]结果显示:本发明设计的祀向survivin基因的s_siRNA_l作用后的肿瘤细胞株肺癌A549、骨肉瘤U20S、乳腺癌MDA-MB-231分裂明显减少、细胞的生长也受到明显抑制，小分子干扰RNA在20nM至10nM对，作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果，见表1.
[0065]表ls-siRNA-Ι作用于肿瘤细胞48小时的抑制率
[0066]
__20nM_50nM_10nM
A549 (%) 51.4±1.2 61.8± 0.7 73.7 ±2.5 U20S (%) 22.7±1.8 39.2±3.2 41.5土0.9 ΜΡΑ-ΜΒ-231(%)25.8±3.1_34.3±1.8_48.3±1.7
[0067]由于细胞株Α549、细胞株U20和细胞株MDA-MB-231分别为肺癌细胞株、骨肉瘤细胞株和乳腺癌细胞株，所以本发明所述的s-siRNA-Ι可以用于肺癌、骨肉瘤和乳腺癌的治疗。
【权利要求】
1.一种双链SiRNA分子，其特征是由下述核苷酸序列的正义链和反义链组成: 正义链 5' -CGUCAUCUGGCUCCCAGCC UUCCX-3'， 反义链 5' -GGAAGGCUGGGAGCCAGAU GACGX-3'，其中 X 代表 tt、TT 或 UU，t 代表脱氧胸腺嘧啶。
2.—种siRNA表达质粒,其特征在于,所述质粒包含权利要求1所述的双链siRNA分子的脱氧核糖核酸序列。
3.一种Survivin基因沉默试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求权利要求1所述的双链siRNA分子，或者包含权利要求2所述的siRNA表达质粒。
4.一种沉默细胞Survivin基因表达的方法,包括以下步骤: 1)将细胞按IX 14/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱细胞培养24小时。 2)用Opt1-ΜΕΜ分别稀释权利要求1所述的siRNA分子和LipofectamineRNAiMAX,将两者混合，室温下孵育10-20分钟。 3)将第2)步所得的混合物加入第I)步培养细胞中，在37°C孵育24-48小时。
5.权利要求1所述的siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病、皮肤鳞癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、黑色素瘤中的至少一种。
【文档编号】C12N15/63GK104164434SQ201310180793
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月16日 优先权日:2013年5月16日
【发明者】王天有, 余波, 唐锁勤, 周晨光, 李剑光 申请人:首都儿科研究所, 杭州普施康生物科技有限公司, 中国人民解放军总医院