一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，该方法将促进剂SRpf添加至联苯降解菌的富集培养过程中，经不断驯化，获得具有高效联苯降解性能的富集液；促进剂SRpf的添加能显著提高菌体生长量、菌群多样性，及联苯降解率，具体为：菌体生长量提高30-50%、联苯降解率提高20-70%、香农多样性指数由1.56-1.70提高至2.10-2.34。本发明所涉及的促进剂SRpf具有复苏VBNC菌群，促进菌体生长的功能。因此，促进剂SRpf不仅可以用于富集高效联苯降解菌群，亦可用于促进其它有机污染物降解菌群的生长，为探索PCBs、PAHs等污染环境中潜在降解菌群，提供一种安全、廉价、高效的方法。
【专利说明】—种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于污染物微生物降解领域，尤其涉及一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法。
【背景技术】
[0002]联苯(Biphenyl)天然存在于煤焦油、天然气、原油中，通过化石燃料的燃烧进入环境中。在工业生产中，联苯经单质碘和氯化铁催化，可产生209种同系物，这一类化合物称为多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,简称PCBs)。PCBs因具有较好的阻燃性、高绝缘性及热稳定性，曾被广泛应用于变压器、电容器绝缘油、燃料分散剂、润滑剂、增塑剂和涂料等。PCBs作为12种持久性有机污染物(POPs)之一，由于环境持久性及“三致”效应而成为目前广泛关注的一种典型异生型有机污染物。由于PCBs属于难降解的异生型有机物，可在自然环境中存在数十年以上，因此，虽然PCBs已禁用多年，但它所造成的环境污染问题随着研究的深入而日益突出。由于PCBs独特的化学稳定性，传统的物理和化学方法因存在低效、二次污染等问题而成为应用瓶颈，微生物作为大量存在的自然资源，且微生物降解治理技术具有安全、高效、经济等特点，因此，PCBs污染环境的微生物修复技术具有较好的应用前景。
[0003]PCBs污染环境的微生物修复以矿化或共代谢两种方式进行。一些低氯PCBs可以作为微生物自身生长和繁殖所需的碳源及能源而进行好氧降解。而对于高氯(氯取代数 5)?088，需经厌氧脱氯转化为低氯？088，才能进行好氧降解。其降解途径为:由双加氧酶对2，3位进行氧化，脱氢得到邻苯二酚，再由开环反应的得到苯甲酸。这种代谢途径类似于其他芳香族化合物，如甲苯，联苯。且联苯降解菌在PCBs共代谢中发挥重要作用，大多数联苯降解菌已被证实同样具有降解PCB同系物的作用。另外，在筛选PCBs降解菌时，一般以联苯为唯一碳源，先筛选能利用联苯的菌株，然后再检验其对PCB同系物的降解性能。
`[0004]虽然微生物修复PCBs具有很大的潜力，且进行了大量的研究工作，但目前大多仍限于实验室研究阶段。PCBs高效降解功能菌种资源匮乏成为其推广应用的最大瓶颈。另外，实验室获得的高效降解菌往往在实际修复场地呈现低降解活性，甚至失活的现象。现今，构建PCBs降解工程菌及固定化降解酶虽然是构建高效PCBs降解菌的途径，但存在很多问题，如宿主细胞的选择、基因水平转移及固定化成本高等。
[0005]因此，如何从作为自然环境中绝大部分(90%?99%)微生物资源的活的但非可培养的状态(“viable but non-culturable”,简称VBNC)菌群中，寻找潜在PCBs和联苯降解菌群，提高菌株的降解效能成为打破微生物修复技术在PCBs污染环境中应用瓶颈的关键所在。藤黄球菌复苏促进因子(resuscitation-promoting factor, Rpf )的发现是VBNC状态菌复苏的重要突破。藤黄球菌Rpf不仅可以复苏多种近缘的高GC革兰氏阳性菌，如:结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii),耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)和鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)等。同时,对低GC革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌(Curvibacter fontana sp.)也有较好的复苏促进功能。目前,对于Rpf复苏及促进作用的关注，主要集中于医学、流行病学流域，而未从微生物资源及环境功能角度展开研究。
[0006]综上所述，利用含Rpf 的促进剂 SRpf (Supernant from Micrococcus Iuteuscontaining Rpf)不仅可以用于富集高效联苯降解菌群，提高菌群的降解效能，成为获得高效联苯降解菌群的关键突破。另外，促进剂SRpf亦可用于促进其它有机污染物降解菌群的生长，为探索PCBs、PAHs等污染环境中潜在降解菌群，提供一种安全、廉价、高效的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有PCBs污染环境的微生物修复技术中存在的菌种降解效能低、生长速度慢，耐受浓度低的不足，提供一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法。该方法操作简便、高效、无二次污染。
[0008]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，包括以下步骤:
[0009](I)将藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种于LMM液体培养基，使其培养液 OD6tltol 为 0.05-0.2 ;LMM 液体培养基组成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L 的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的维生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的 L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L 的矿质盐溶液(0.375g/LCuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/L Na2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20)，pH 为 6.5-8.0，培养 24_36h，获得种子培养液；
`[0010](2)将步骤I获得的种子培养液按3-5%(v/v)的接种量接种至LMM液体培养基中，160r/min,培养 48_60h，将发酵液离心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌体，经 0.22 μ m过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34mg/L，保存于_20°C条件下备用；
[0011](3)将步骤2获得的促进剂SRpf按体积分数为15%添加到以联苯为唯一碳源的无机盐培养基中，混匀后得富集培养基，其中无机盐培养基的组成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L的(NH4)2SO4, (λ OI g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量盐溶液(4mg/L 的 Mo03，28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20), pH为 7.3-7.5，联苯为 500-3000mg/L ；
[0012](4)取PCBs污染土壤加入至步骤3获得的富集培养基中，PCBs污染土壤与富集培养基的质量体积比为35-65g/L ；30°C、180-200r/min摇床培养，每代培养3_5d，传代培养5-6次，初始联苯浓度为500mg/L，以500mg/L递增，富集培养基中联苯浓度达2500_3000mg/L ；
[0013](5)将步骤4获得的培养液按4-6% (v/v)的接种量接种至含500_4500mg/L联苯的无机盐培养基中，300C、180-200r/min,培养24_64h。
[0014]将步骤5获得的发酵液进行联苯降解率和菌体生长量测定，结果表明添加促进剂SRpf的效果显著，具体为:菌体生长量提高30-50%、联苯降解率提高20-70%、香农多样性指数由 1.56-1.70 提高至 2.10-2.34。
[0015]本发明与现有的联苯降解菌富集方法相比，其有益效果是:[0016]1、本发明所用促进剂SRpf由藤黄球菌分泌，具有成本低廉、原料易得、安全无毒、操作简便等特点。
[0017]2、本发明利用促进剂SRpf的复苏促进作用，不仅可以复苏PCBs污染土壤中的VBNC菌群，而且可以促进低降解效能菌群的生长。从而富集高效联苯降解菌群，充分发挥PCBs污染土壤中土著微生物的作用。
[0018]3、本发明中将促进剂SRpf添加至联苯降解菌群的富集培养基中，通过与添加失活的SRpf (促进剂SRpf经121°C，高压灭菌20min)进行对比，表明促进剂SRpf的添加能显著提高菌体生长量、菌群多样性，及联苯降解率。
[0019]4、本发明按体积分数为15%添加促进剂SRpf，30°C、180-200r/min，培养24h，对1500mg/L联苯，降解率为95.7-98.2%，可知促进剂SRpf能有效提高联苯降解率，同时具有快速、无二次污染等特点，充分体现出实用性、经济性、环保性的循环经济特征，极具推广应用价值。
[0020]5、本发明中的促进剂SRpf不仅可以用于富集高效联苯降解菌群，亦可用于促进其它有机污染物降解菌群的生长，为探索PCBs、PAHs等污染环境中潜在降解菌群，提供一种安全、廉价、高效的方法。
[0021]综上所述，本发明符合绿色安全的环保理念，实现了微生物资源化，能有效发挥PCBs污染环境中土著微生物的降解特性，为促进微生物修复技术的推广应用提供一种安全无毒、成本低廉的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是添加促进剂SRpf对菌体生长量和联苯降解率的影响图。
【具体实施方式】.
[0023]本发明利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，包括以下步骤:
[0024](I)将藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)接种于LMM液体培养基，使其培养液 OD6tltol 为 0.05-0.2 ;LMM 液体培养基组成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02g/L 的 L-蛋氨酸，0.04g/L 的维生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的 L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L 的矿质盐溶液(0.375g/LCuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/L Na2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20,溶剂为水)，pH为6.5-8.0,培养24_36h，获得种子培养液；
[0025](2)将步骤I获得的种子培养液按3-5%(v/v)的接种量接种至LMM液体培养基中，160r/min,培养 48_60h，将发酵液离心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌体，经 0.22 μ m过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34mg/L,保存于_20°C条件下备用；
[0026](3)将步骤2获得的促进剂SRpf按体积分数为15%添加到以联苯为唯一碳源的无机盐培养基中，混匀后得富集培养基，其中无机盐培养基的组成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4,0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L的(NH4)2SO4, (λ OI g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量盐溶液(4mg/L 的 Mo03，28mg/L 的 ZnSO4.5Η20，0.02mg/L 的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶剂为水)，pH 为 7.3-7.5，联苯为 500-3000mg/L ；
[0027](4)取PCBs污染土壤加入至步骤3获得的富集培养基中，PCBs污染土壤与富集培养基的质量体积比为35-65g/L ；30°C、180-200r/min摇床培养，每代培养3_5d，传代培养5-6次，初始联苯浓度为500mg/L，以500mg/L递增，富集培养基中联苯浓度达2500_3000mg/L ；
[0028](5)将步骤4获得的培养液按4-6% (v/v)的接种量接种至含500_4500mg/L联苯的无机盐培养基中，300C、180-200r/min,培养24_64h。
[0029]将步骤5获得的发酵液进行联苯降解率和菌体生长量测定，结果表明添加促进剂SRpf的效果显著，具体为:菌体生长量提高30-50%、联苯降解率提高20-70%、香农多样性指数由 1.56-1.70 提高至 2.10-2.34。
[0030]下面根据实施例详细描述本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显:
[0031]本发明利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，包括以下步骤:
[0032]1、促进剂SRpf的制备
[0033]藤黄球菌(Micrococcus Luteus IAM14879)可购于日本理化学研究所微生物菌种
保藏中心。
[0034]LMM 培养基组成为:4.0g/L NH4Cl, 1.4g/L KH2PO4,0.005g/L 生物素，0.02g/LL-蛋氨酸，0.04g/L 维生素 BI, 1.0g/L 肌苷，0.03g/L MgSO4,8.0I g/L L-乳酸锂盐，2.0ml/L 矿质盐溶液(0.375g/L CuSO4.5Η20，0.785g/L MnCl2.4Η20，0.18g/LFeS04.7Η20，0.029g/LNa2MoO4.2Η20，0.089g/L ZnSO4.7Η20), pH 为 7.5。
[0035]菌种活化与种子液的 培养:从斜面试管将M.1uteus接种于培养皿中，30°C培养3d。挑取3环M.1uteus菌苔至装有50mL LMM液体培养基的250mL三角瓶中，30°C，160r/min，培养 36h。
[0036]M.1uteus发酵培养:取种子培养液按4% (v/v)的接种量将接入装有15mLLMM培养液的50mL三角瓶中，300C，160r/min培养48h。
[0037]2、联苯降解菌的富集培养
[0038]无机盐培养基的组成为:lg/LKH2PO4, 3g/L K2HPO4.3H20，0.2g/L MgSO4,0.02g/L FeSO4.7H20,1 g/L NaCl, 3g/L (NH4) 2S04,0.0lg/L CaCl2,微量盐溶液 2mL/L (4mg/LMoO3, 28mg/L ZnSO4.5H20,0.02mg/L CuSO4.5H20,4mg/L H3BO3,4mg/L MnSO4.5H20,4mg/LCoCl2.6H20), pH 为 7.3。
[0039]富集培养基:联苯含量为:500-2500mg/L，处理组:无机盐培养基中按15% (体积分数)添加促进剂SRpf，对照组:无机盐培养基中按15% (体积分数)添加失活的SRpf。
[0040]富集培养:取5g 土壤分别加到装有IOOmL含500mg/L联苯的处理组与对照组的富集培养基中，300C，180r/min培养6d后，将第一代的富集液按6%接种量接种至装有50mL含1000mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30°C，180r/min摇床培养6d后，将第二代的富集液按4%接种量接种至装有50mL含1500mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30°C，180r/min摇床培养4d后，将第三代的富集液按4%接种量接种至装有50mL含2000mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，30°C，180r/min摇床培养3d后，将第四代的富集液按4%接种量接种至装有50mL含2000mg/L联苯的富集培养基的150mL三角烧瓶中，300C，180r/min摇床培养，经5代富集培养后，富集液最终联苯浓度达到2500mg/L，分别获得对照组与处理组富集培养液。
[0041]3、促进剂SRpf添加对菌体生长和联苯降解率的影响
[0042]将对照组和处理组的富集液按5%的接种量接种至装有20mL分别含500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500mg/L联苯的无机盐培养液中，每个浓度均做三组平行实验，30°C>200r/min,培养64h后,加入等体积的乙酸乙酯萃取,振荡25min后,倒入50ml比色管中，静置20min，取上层有机相逐级稀释后，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定联苯的残留量，取下层无机相进行菌体生长量的测定。
[0043]联苯含量的测定:取上层有机相测定残留的联苯浓度。GC-MS测定的条件:GC条件:GC (Agilent7890)进行测定，DB-5石英毛细管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m);检测器放射源为63Ni ;进样口温度:270°C ;检测器温度:280°C ;载气:高纯氮气，恒流1.0mL/min ;无分流进样I μ L。升温程序为:始温70°C,保持Imin, 30°C /min升至280°C,保持7min,总运行时间8min。MS条件:MS (5975C inter MSD)EI离子源温度为200°C，四级杆温度150°C，检测模式为选择离子扫描，溶剂延迟3min。联苯有三种选择离子，m/z分别为152、153、154。TMX有四种选择离子，m/z分别为207、209、242、244。
[0044]菌体生长量(OD6tltl)的测定:菌体生长是通过测定600nm下的光密度值(0D_)进行表示。取无机相发酵液，10000r/min离心IOmin,收集菌体,蒸懼水洗漆3次后稀释至原体积，用UV-5500 (PC)型分光光度计在波长600nm处测定光密度值，以OD6tltl来表示菌体生长量。
[0045]经分析测定，结果表明促进剂SRpf的添加能显著提高菌体生长量和联苯降解率，具体为:菌体生长量提高30-50%，联苯的降解率提高20-70%，见图1。4、促进剂SRpf添加对菌群多样性的影响.
[0046]将富集培养5代后的处理组与对照组富集液，分别提取总DNA，用细菌16SrDNA弓丨物F357-GC/R518对所提取的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系50 μ L包括=EasyTaqMix: 25 μ L，引物 338F-GC(5’-CGCCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，)和 518R(5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)各 I μ L，模板 DNA2 μ L,去离子水:21 μ L。PCR反应条件为:94°C预变性4min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸20s，进行30个循环，72°C终延伸5min，16°C保持。扩增片段约为200bp，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测进行变形梯度凝胶电泳(DGGE)，DGGE采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为30%?60%，PCR产物上样量为45 μ L，加入20 μ L的6 X loading buffer, I X TAE, 160V电压条件下电泳6h。电泳后染色30min，拍照。根据呈现的条带数目和亮度来分析菌群的结构变化及优势菌群。通过Quantity 0ne4.0软件处理DGGE图谱,分析每个泳道中各个条带的峰值密度,计算香农多样性指数(Shannon-Weaver diversity index, H):Η=_ Σ (rij/N) log (rij/N),其中 Iii 为每个条带的峰值密度，N为所有条带峰值总和，S为DNA条带数。
[0047]富集液的外观及DGGE分析结果显示，对照组和处理组的香农多样性指数分别为
1.76和2.11，表明促进剂SRpf的添加使得菌体生长量与菌群多样性得到明显提高。
【权利要求】
1.一种利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O将藤黄球菌接种于LMM液体培养基，使其培养液OD6tltol为0.05-0.2 ；LMM液体培养基组成是:2.5-4.5g/L 的 NH4Cl, 1.0-2.0g/L 的 KH2PO4,0.005g/L 的生物素，0.02 g/L 的L-蛋氨酸，0.04 g/L 的维生素 BI,0.5-1.5g/L 的肌苷，0.03g/L 的 MgSO4,8.0-10.0g/L 的L-乳酸锂盐，1.5-3.0ml/L的矿质盐溶液，pH为6.5-8.0 ;培养24_36h，获得种子培养液； (2)将步骤I获得的种子培养液按3-5%(v/v)的接种量接种至LMM液体培养基中，160r/min,培养 48_60h，将发酵液离心(8000-10000r/min) 10_15min 去除菌体，经 0.22 μ m过滤膜进行无菌过滤，所获得的上清液即为促进剂SRpf，其蛋白含量为23.96-25.34 mg/L，保存于-20 C条件下备用； (3)将步骤2获得的促进剂SRpf按体积分数为15%添加到以联苯为唯一碳源的无机盐培养基中，混匀后得富集培养基，其中无机盐培养基的组成是:l_2g/L的KH2PO4,2.5-3.5g/L 的 K2HPO4.3Η20，0.2g/L 的 MgSO4, 0.02g/L 的 FeSO4.7Η20，I g/L 的 NaCl，2_4g/L 的(NH4)2SO470.01 g/L 的 CaCl2, 2mL/L 的微量盐溶液，pH 为 7.3-7.5，联苯为 500_3000mg/L ； (4)取PCBs污染土壤加入至步骤3获得的富集培养基中，PCBs污染土壤与富集培养基的质量体积比为35-65g/L ；30°CU80-200r/min摇床培养，每代培养3_5d，传代培养5_6次，初始联苯浓度为500mg/L，以500mg/L递增，富集培养基中联苯浓度达2500_3000mg/L ； (5)将步骤4获得的培养液按4-6%(v/v)的接种量接种至含500-4500mg/L联苯的无机盐培养基中，300C、180-200r/min,培养 24_64h。
2.根据权利要求1.所述利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，其特征在于，所述步骤I中，所述矿质盐溶液的组成为:0.375g/L的CuSO4.5H20，0.785g/L的MnCl2.4Η20，0.18g/L 的 FeSO4.7Η20，0.029g/L 的 Na2MoO4.2Η20，0.089g/L 的 ZnSO4.7H20,溶剂为水。
3.根据权利要求1所述利用促进剂SRpf富集高效联苯降解菌群的方法，其特征在于，所述步骤I中，所述微量盐溶液的组成为:4mg/L的Mo03，28mg/L的ZnSO4.5H20，0.02mg/L的 CuSO4.5H20，4mg/L 的 H3BO3,4mg/L 的 MnSO4.5H20，4mg/L 的 CoCl2.6H20，溶剂为水。
【文档编号】C12R1/265GK103436460SQ201310254289
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月24日 优先权日:2013年6月24日
【发明者】苏晓梅, 沈超峰, 胡金星, 秦智慧, 黄荣浪 申请人:浙江大学