一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统包括食品级宿主干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936和食品级表面展示载体pQJ5；同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，即采用融合基因取代载体上的基因，转入宿主中并检测其在宿主细胞表面的表达情况。本发明的食品级表面展示系统，同时具备食品级的宿主和食品级的载体，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，因其不含抗生素抗性筛选标记，故不存在潜在的生物可转移性危害。同时通过构建的宿主和载体，配合融合基因，实现了异源蛋白的表达。
【专利说明】一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用。
[0003]【背景技术】
据估算，地球上每年有大约1500万人死于传染性疾病，大约占到总死亡人数5700万的25%。疫苗接种是人类对抗细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病的有效手段，一直是人们关注和研究的热点之一。基因工程载体疫苗，指利用非致病微生物作为载体，将病菌的保护性抗原基因片段重组到载体微生物中，用表达保护性抗原的微生物作为疫苗。痘苗病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒等是常用的病毒载体，沙门氏菌和卡介苗则是常用的细菌载体。这些疫苗载体的共同特点是，它们多为致病菌的减毒苗，可能存在潜在的危害性。如能利用非致病菌尤其是益生菌作为疫苗载体，将大大提高疫苗的安全性。
[0004]乳杆菌(Lactobacilli)是乳酸菌中最大的一个属，长期以来一直被应用于食品发酵和保存中(酸奶中含有多种乳杆菌)，被公认为“安全级”(generally recognized assafe,GRAS)微生物，因此用乳杆菌作为载体传递抗原进行免疫有着诱人的前景。这些菌株经过分子遗传修饰，带有目的病原的抗原成分，口服或注射后，可以产生特异的局部或全身免疫反应。而乳杆菌自身的一些特点，如:在肠道吸附定植的能力；对胃酸、胆汁的耐受性；产生抗菌物质的特性等，更使其成为基因工程载体疫苗的最佳选择。
[0005]干酪乳杆菌是一种在食品和医疗领域具有重要应用前景的食品级微生物。近年来，干酪乳杆菌的基因克隆和 表达系统引起了人们的广泛关注，其中很重要的一个研究方向就是利用干酪乳杆菌表达系统进行基因工程疫苗的构建。国内外利用干酪乳杆菌构建了能引起机体免疫应答的多株基因工程疫苗，但大多利用抗生素标记基因如氯霉素抗性基因和红霉素抗性基因作为整个系统的筛选标记，这些标记基因的生物可转移性可能危害人类健康，从而限制了这一类干酪乳杆菌基因工程疫苗在食品和医药等工业的应用。
[0006]要想构建完全食品级的基因工程疫苗，必需同时具备食品级的宿主和食品级的载体，而且宿主和载体必需具有可以完成互补筛选的食品级标记。目前，这方面的研究主要集中在乳酸乳球菌上，对于干酪乳杆菌的研究较少。
[0007]经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号200910192146.X，公告日2010-02-24，公开了一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N，该乳酸菌食品级表达载体以天然食品防腐剂乳链菌肽Nisin抗性基因nisi作为选择标记。
[0008]中国专利文献号CN200410093875.7，授权公告日2007_11_21，公开了一种乳酸乳球菌的食品级载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。
[0009]中国专利文献号CN200610154649.4，授权公告日2010-09-08，公开了两种乳酸乳球菌食品级载体PNIl和pNI2，这两个载体分别利用乳酸链球菌素(Nisin)免疫基因和抗性基因为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。
[0010]中国专利文献号CN200710175269.3，授权公告日2010-09-08，公开了一种乳酸乳球菌食品级分泌表达载体，该载体以胸苷酸合成酶基因thyA为选择标记，且使用宿主为乳酸乳球菌。
[0011]
【发明内容】
[0012]本发明的目的在于解决上述已有技术存在的不足，提供一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统并利用该系统实现异源蛋白的成功表达，本系统中所有DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记。
[0013]本发明的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，特殊之处在于包括食品级宿主干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) Q-5和食品级表面展示载体pQJ5。
[0014]所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所)，保藏号为CGMCC 7936。
[0015]所述食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936是对干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) ATCC 334进行质粒消除并筛选而获得，丧失了代谢乳糖的能力。
[0016]所述质粒消除是包括亚致死高温诱导的质粒消除或新霉素诱导的质粒消除。
[0017]所述食品级表面展示载体pQJ5，其碱基序列如序列表所示。
[0018]所述食品级表面展示载体pQJ5是通过如下方案获得:
在乳酸菌表达载体PNZ2102的基础上保留来源于乳酸链球菌的pSH71复制子和PlacA启动子，敲除编码氯霉素抗性基因的碱基序列，插入来源于干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因IacEUacG和lacF，插入来自于嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因slpA及其启动子和信号肽。
[0019]所述干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因IacEUacG和IacF是食品级表面展示载体PQJ5与食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936完成互补筛选的食品级标记。
[0020]所述嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因slpA及其启动子和信号肽序列是用于实现异源蛋白在细胞表面表达的DNA兀件。
[0021]本发明同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，通过如下方案实现:
采用重组PCR方法构建报告基因绿色荧光蛋白基因gfp和S-层蛋白基因slpA的融合基因slpA-gfp，并用该融合基因取代载体pQJ5上的slpA，采用电转化法将构建好的载体PQJ5质粒转入干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936中，运用激光共聚焦显微镜法检测绿色荧光蛋白在干酪乳杆菌细胞表面的表达。
[0022]本发明一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，同时具备食品级的宿主和食品级的载体，且宿主和载体具有可以完成互补筛选的食品级标记，因其不含抗生素抗性筛选标记，故不存在潜在的生物可转移性危害。同时通过构建的宿主和载体，配合融合基因，实现了异源蛋白的表达。[0023]
【专利附图】
【附图说明】
[0024]食品级宿主干酪乳杆菌Q-5于2013年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC 7936。
[0025]图1:本发明的食品级宿主菌株干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936与出发菌株干酪乳杆菌ATCC 334代谢乳糖能力的比较结果；
图2:本发明的食品级表面展示载体pQJ5的构建流程图；
图3:利用本发明的食品级表面展示系统表达绿色荧光蛋白的效果图4和0是携带重组质粒pQJ5_gfp的干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936 ；B是携带携带pQJ5的干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936 ；C 为干酪乳杆菌 ATCC 334。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]以下参照附图，给出本发明的【具体实施方式】，用来对本发明的构成进行进一步说明。
[0028]实施例1
1、本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株和质粒:
①干酪乳杆菌(Lactobacil`luscasei) ATCC 334 (含有一个约29 kb的内源性质粒，能利用乳糖且其乳糖代谢基因IacEUacG和IacF位于该内源性质粒上，购自美国标准生物品收藏中心ATCC )
②干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)Q-5 CGMCC7936 (干酪乳杆菌ATCC 334的质粒消除衍生物，丧失了乳糖利用能力，本发明的食品级宿主)
③嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CICC 6075 (S-层蛋白基因及其启动子和信号肽的供体菌株，购自中国工业微生物菌种保藏中心CICC)
④大肠杆菌(Escherichiacoli) DH5 α (属于公知技术)
⑤pNZ2102(pSH71复制子和PlacA启动子的供体质粒，氯霉素抗性，Platteeuw etal., 1996.Appl Environ Microbiol 62:1008 - 1013)
⑥pBAD-GFPuv(绿色突光蛋白基因的供体质粒,氨卞抗性,Fisher and Mintz, 2000.J Ind Microbiol Biotechnol 24:323 - 326)
⑦PQJ5(食品级表面展示载体，以乳糖代谢基因为筛选标记基因，利用S-层蛋白基因启动子和信号肽实现异源蛋白在细胞表面的表达，本发明的食品级载体，其碱基序列如序列表所示)
⑧pQJ5-gfp(pQJ5上表达绿色荧光蛋白基因，本发明的表达异源蛋白的质粒)
2、食品级宿主干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei) Q-5的构建 ①干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC 334的质粒消除
采用亚致死高温诱导的质粒消除法或新霉素诱导的质粒消除法完成干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) ATCC 334 的质粒消除工作。
[0029]亚致死高温诱导的质粒消除是指:将干酪乳杆菌ATCC 334的单菌落接种到MRS液体培养基中培养，培养温度40~45°C，培养时间24~72小时，然后取菌悬液按1%~10%的接种量接种到新鲜MRS液体培养基中继续培养24~72小时，按此方法传代8次后，用接种环取少量菌液在含15~20克/升琼脂的MRS固体培养基上划出单菌落，利用PCR法筛选出质粒消除的菌株，并验证所得菌株代谢乳糖的能力。
[0030]新霉素诱导的质粒消除是指:将干酪乳杆菌ATCC 334的单菌落接种到含新霉素10微克/毫升的MRS液体培养基中培养，培养温度37°C，培养时间24~72小时，然后取菌悬液按1%~10%的接种量接种到新鲜MRS液体培养基中继续培养24~72小时，按此方法传代8次后，用接种环取少量菌液在含15~20克/升琼脂的MRS固体培养基上划出单菌落，利用PCR法筛选出质粒消除的菌株，并验证所得菌株代谢乳糖的能力。
[0031]②质粒消除菌株的PCR筛选
根据NCBI上已经公布的干酪乳杆菌ATCC 334的内源性质粒的DNA序列信息(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008502.1 )，设计两对特异性引物，序列如下: yzl:5’ -TTTCCTGCGGTGTCG-3’ yz2:5’ -TTCGCCTTTGTTCTACTG-3’ yz3:5’ -TGCCATCTGGGAGTTT-3’ yz4:5’ -GGCTTATGCGAAGTTTT-3’
若质粒未消除，以yzl和yz2为引物进行PCR扩增可获得1440bp片段。
[0032]若质粒未消除，以yz3和yz4为引物进行PCR扩增可获得602bp片段。
[0033]若质粒已消除，两对引物均不能扩增出特异性条带。
[0034]经PCR筛选获得一株利用两对引物均不能获得特异性条带的干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936，其可能为质粒消`除的菌株。
[0035]③质粒消除菌株代谢乳糖能力的鉴定
在LMRS培养基中培养上述获得的可能的质粒消除菌株Q-5 CGMCC7936和出发菌株干酪乳杆菌ATCC 334，48~72小时后检测菌悬液的光密度、培养液中乳糖的消耗量以及L-乳酸的生产量。
[0036]LMRS培养基每升中含有:乳糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，柠檬酸三铵2克，乙酸钠5克，磷酸氢二钾2克，七水硫酸镁0.2克，一水硫酸锰0.05克，余量为水，pH为6~7。
[0037]其中，光密度的检测方法为:将菌悬液稀释后利用分光光度计检测，检测波长为600nm。
[0038]乳糖的检测方法为:利用爱尔兰Megazyme公司的Sucrose/Lactose/D-GlucoseKit K-LACSU 01/12试剂盒进行检测。
[0039]L-乳酸的检测方法为:利用爱尔兰Megazyme公司的L-lactic acid Kit K-LATE07/11试剂盒进行检测。
[0040]两株菌株代谢乳糖能力的具体比较结果见附图1，菌株Q-5 CGMCC7936基本丧失了利用乳糖的能力，是干酪乳杆菌ATCC 334的质粒消除衍生物。将该菌株实验室命名为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei )Q_5,并于2013年07月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC 7936。[0041]3、食品级表面展示载体pQJ5的构建 ①乳糖代谢基因的克隆
根据干酪乳杆菌ATCC 334的内源性质粒上的乳糖代谢基因序列，设计一对引物L9和L8，具体序列如下:
L9:5’ -GCGCTGCAGACGCTTATGCTTTGGCTTCC-3’
L8:5’ -GCGCTCGAGTTACTGCTTGTTCTCAAGTT-3>
其中L9上划线部分为PstI酶切位点，L8上划线部分为XhoI酶切位点。
[0042]以干酪乳杆菌ATCC 334的全基因组为模板，利用引物L9和L8进行PCR扩增，并测序验证，获得约3.6 kb基因片段，该基因片段包含了乳糖代谢的三个关键基因lacE、IacG和lacF，其序列同NCBI上公布的干酪乳杆菌ATCC 334内源性质粒上的乳糖代谢基因具有100%的一致性。
[0043]利用PstI和XhoI对该片段进行双酶切后，连接到同样利用PstI和XhoI双酶切的质粒PNZ2102上，后转化到大肠杆菌DH5 α，再涂布到含氯霉素20微克/毫升的LB固体培养基上，得到单菌落后，利用引物L9和L8进行菌落PCR筛选，对其中的阳性转化子在LB液体培养基中培养18小时后，提取质粒，并利用PstI和XhoI双酶切验证，最终成功获得重组质粒 pNZ2102-lacEGF。
[0044]LB培养基每升中含有:酵母粉5克，胰蛋白胨10克，氯化钠10克，琼脂粉17克(只在配制固体培养基时添加)，余量为水，pH为6.5~7。
[0045]②S-层蛋白基因及其启动子和信号肽的克隆 根据已公布的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的S-层蛋白基因及其启动子和信号肽序列，设计一对引物P5和P6，具体序列如下:
P5:5， - CGCAGATCTGGGATGAAATAAAGCCAATA-3?
P6:5’ - CGCGAATTCTCTAAAGTTTGCAACCTTA-3，
其中P5上划线部分为BglII酶切位点，P6上划线部分为EcoRI酶切位点。
[0046]以嗜酸乳杆菌CICC 6075的全基因组为模板，利用引物P5和P6进行PCR扩增，并测序验证，获得约1.8 kb基因片段，该基因片段包含了 S-层蛋白基因及其启动子和信号肽序列，其序列同已经公布基因组的嗜酸乳杆菌NCFM的S-层蛋白基因及其启动子和信号肽序列具有99%的一致性。
[0047]③S-层蛋白基因及其启动子和信号肽取代氯霉素抗性基因
根据重组质粒pNZ2102-lacEGF的序列，设计一对引物Cl和C2，用于扩增该质粒中除了氯霉素抗性基因以外的全部序列，引物具体序列如下:
Cl:5’ -gatctcagaattcgagct-3，
C2:5’ -gcgagatctCAATAATCCCTCCTCT-3，
其中Cl上划线部分为EcoRI酶切位点，C2上划线部分为BglII酶切位点。
[0048]以质粒pNZ2102_lacEGF为模板，利用引物Cl和C2进行PCR扩增，并测序验证，获得约5.8 kb基因片段，该基因片段包含了 pNZ2102-lacEGF上除了氯霉素抗性基因以外的全部序列。
[0049]利用EcoRI和BglII双酶切上述获得的5.8 kb基因片段，同样利用EcoRI和BglII双酶切上述获得的1.8 kb S-层蛋白基因及其启动子和信号肽序列，利用T4 DNA连接酶连接两个DNA片段，连接产物经纯化后电转化到干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936感受态细胞中，电击电压为900伏/毫米，电击后的菌液在含10%蔗糖的MRS培养基中复苏3小时候后涂布到以乳糖为唯一碳源的LMRS固体培养基上，培养48~72小时后得到单菌落，利用引物P5和P6进行菌落PCR筛选，对其中的阳性转化子在LMRS液体培养基中培养36~48小时后，提取质粒，利用EcoRI和BglII双酶切验证。最终成功获得不含任何抗生素标记的食品级表面展示载体，实验室命名为PQJ-5，其序列如SEQ ID NO:1所示。[0050]MRS培养基每升中含有:葡萄糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，柠檬酸三铵2克，乙酸钠5克，磷酸氢二钾2克，七水硫酸镁0.2克，一水硫酸锰0.05克，余量为水，pH为6~7。
[0051]LMRS培养基每升中含有:乳糖20克，酵母粉5克，胰蛋白胨10克，牛肉浸粉10克，柠檬酸三铵2克，乙酸钠5克，磷酸氢二钾2克，七水硫酸镁0.2克，一水硫酸锰0.05克，琼脂粉17克(只在配制固体培养基时添加)，余量为水，pH为6~7。
[0052]食品级表面展示载体pQJ5的具体构建流程可参考附图2。
[0053]4、利用本发明所构建的食品级表面展示系统异源表达绿色荧光蛋白
设计两对引物利用重组PCR方法构建S-层蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的融合基因，引物序列如下:
Pl:5’ -TGCAGATCTGGGATGAAATAAAGCCAATA-3>
P2:5’ -CCTTTACTCATTCTAAAGTTTGCAACCTTA-3’
P3:5， -CAAACTTTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-3，
P4:5’ -CGCGAATTCTTATTTGTATAGTTCATCCAT-3>
其中Pl上划线部分为BglII酶切位点，P4上划线部分为EcoRI酶切位点，P2和P3上部分序列是互补序列。
[0054]以质粒pQJ5为模板，利用引物Pl和P2进行PCR扩增；以质粒pBAD_GFPuv为模板，利用引物P3和P4进行PCR扩增；将两次PCR扩增的产物混合后取微量作为重组PCR的模板，以引物Pl和P4进行扩增，获得约2.6 kb基因片段，经测序验证，S-层蛋白基因和绿色荧光蛋白基因成功融合到一起，命名为slpA-gfp。
[0055]利用EcoRI和BglII双酶切slpA-gfp,同样利用EcoRI和BglII双酶切载体pQJ5去除其中的slpA基因，利用T4 DNA连接酶连接两个DNA片段，连接产物经纯化后电转化到干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936感受态细胞中，电击电压为900伏/毫米，电击后的菌液在含10%蔗糖的MRS培养基中复苏3小时候后涂布到以乳糖为唯一碳源的LMRS固体培养基上，培养48~72小时后得到单菌落，利用引物Pl和P4进行菌落PCR筛选，对其中的阳性转化子在LMRS液体培养基中培养36~48小时后，提取质粒，利用EcoRI和BglII双酶切验证，最终成功构建干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936/pQJ5-gfp。
[0056]在MRS培养基中培养干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936/pQJ5_gfp 24~48小时，离心收集细胞并用0.85%的生理盐水洗涤菌体，利用激光扫描共聚焦显微镜(德国莱卡)检测干酪乳杆菌细胞表面绿色荧光蛋白的表达情况，具体结果可见附图3。
[0057]序列表 〈110〉滨州医学院
〈120〉一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统及其在异源蛋白表达中的应用〈160〉 I
〈210〉 I
<211>7695
<212>DNA
〈213〉干酷乳杆菌 ILactobaciIIus casei)
〈221〉食品级表面展示载体pQJ5 <400>1
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【权利要求】
1.一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于包括食品级宿主干酪乳杆菌Q-5CGMCC7936和食品级表面展示载体pQJ5。
2.如权利要求1所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936是对干酪乳杆菌(LactobaciIIus casei)ATCC 334进行质粒消除并筛选而获得，丧失了代谢乳糖的能力。
3.如权利要求2所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述质粒消除是亚致死高温诱导的质粒消除或新霉素诱导的质粒消除。
4.如权利要求1所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述食品级表面展不载体PQJ5，其喊基序列如序列表所不。
5.如权利要求1所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述食品级表面展示载体PQJ5是通过如下方案获得: 在乳酸菌表达载体PNZ2102的基础上保留来源于乳酸链球菌的pSH71复制子和PlacA启动子，敲除编码氯霉素抗性基因的碱基序列，插入来源于干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因IacEUacG和lacF，插入来自于嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因slpA及其启动子和信号肽。
6.如权利要求5所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述干酪乳杆菌ATCC 334的乳糖代谢基因lacE、IacG和IacF是食品级表面展示载体pQJ5与食品级宿主干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936完成互补筛选的食品级标记。
7.如权利要求5所述的一套干酪乳杆菌食品级表面展示系统，其特征在于所述嗜酸乳杆菌CICC 6075的S-层蛋白基因SlpA及其启动子和信号肽序列是用于实现异源蛋白在细胞表面表达的DNA元件。
8.本发明同时提供了利用上述干酪乳杆菌食品级表面展示系统实现其异源蛋白表达的方法，其特征在于通过如下方案实现: 采用重组PCR方法构建报告基因绿色荧光蛋白基因gfp和S-层蛋白基因slpA的融合基因slpA-gfp，并用该融合基因取代载体pQJ5上的slpA，采用电转化法将构建好的载体PQJ5质粒转入干酪乳杆菌Q-5 CGMCC7936中，运用激光共聚焦显微镜法检测绿色荧光蛋白在干酪乳杆菌细胞表面的表达。
【文档编号】C12N15/62GK103484415SQ201310315901
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月25日 优先权日:2013年7月25日
【发明者】秦加阳, 王秀文, 许平 申请人:滨州医学院