二氢查耳酮的生物技术生产方法
【专利摘要】本发明给出了关于以下的描述：使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素的方法，所述转基因微生物包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶(enoate?reductase)的基因或由其组成；相应的转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)和/或核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成；以及宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的这样的载体。
【专利说明】二氢查耳酮的生物技术生产方法
[0001]本发明主要涉及使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素(Phloretin)的方法，或者还原黄烷酮(flavanones)的方法，所述转基因微生物包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶(enoate reductase)的基因或由其组成。
[0002]本发明还涉及这样的转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)以及核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
[0003]本发明还涉及这样的载体，尤其是质粒载体，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’ )和/或核酸区段(b)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
[0004]此外，本发明涉及这样的宿主细胞，其包含一种或更多种相同或不同的根据本发明的载体。
[0005]根据下面的描述、实施例，尤其是所附权利要求，本发明的其他方面是显而易见的。
[0006]二氢查耳酮(尤其是根皮素)通常通过查耳酮的化学还原或通过用二氢肉桂酸使酹发生傅-克酰基化(Friedel-Crafts acylation)来生产。该方法的缺点在于以该方式生产的食品添加剂、调味剂或芳香物质不能被描述为天然的。此外，可通过提取例如相应的糖苷(例如从苹果属(Malus spp.)原材料)随后生成糖苷配基(aglycone)来得到二氢查耳酮，尤其是根皮素。然而，该工艺耗时且成本高，并且还依赖于季节。
[0007]具有二氢查耳酮结构的重要调味剂和芳香物质是例如根皮素(例如，根据EPl, 998，636-B1)、根皮苷(phloridzin)、三叶苷(trilobatin)(参见 Tanaka, T.；Yamasaki, K.；Kohda, H.；Tanaka, 0.；Mahato, S.B., Dihydrochalcone-glucosides assweet principles of Symplocos ssp.Planta Medical980, (Suppl.), 81-83)、柚皮苷二氢查耳酮(naringin dihydrochalcone)和新澄皮苷二氢查耳酮(neohesperidinedihydrochalcone)(Crosby, G.A., New Sweeteners.Critical Reviews in Food Scienceand Nutritionl976, (June),297-323)。
[0008]由于现在需要并且未来也需要有利的二氢查耳酮，尤其是根皮素，所以本发明的主要问题是提供可以以工业规模用于生产二氢查耳酮尤其是根皮素的有效且优选节约成本的方法。
[0009]另一个问题是提供用于实施这种方法的合适的或必需的手段。
[0010]根据下面的描述，尤其是所附权利要求，本发明的其他问题是显而易见的。
[0011]本发明的主要问题通过使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素的创新性生物技术方法来解决，所述方法包括以下步骤:[0012](i)提供转基因微生物，其包含(作为转基因)
[0013]-核酸区段(a)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，
[0014]和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，
[0015]以及
[0016]-核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
[0017](ii)将一种或更多种黄烷酮(尤其是柚皮苷)和/或其一种或更多种前体或一种或更多种衍生物(尤其是柚皮苷的前体或衍生物)添加到转基因微生物中，并在允许所述黄烷酮和/或其前体或衍生物(尤其是柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物)转化为二氢查耳酮(尤其是根皮素)的条件下培养所述转基因微生物。
[0018](iii)任选地:分离并且如果需要则纯化所述二氢查耳酮(尤其是根皮素)。
[0019]根据本发明使用的所述或一种、更多种或所有黄烷酮或其前体或衍生物优选选自:
[0020]柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、柚皮芸香苷(narirutin)、或其他柚皮素糖苷、橙皮素(hesperetin)、橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、橙皮素-7-0-葡萄糖苷、或其他橙皮素糖苷、圣草酹(eriodictyol)、圣草枸橼苷(eriocitrin)或其他圣草酹糖苷、sterubin、sterubin糖苷、楼花素(sakuranetin)、楼花素糖苷、异楼花素(isosakuranetin)、异楼花素糖苷、4’，7- 二羟基-黄烧酮或其糖苷、4’，7- 二轻基-3’ -甲氧基-黄烷酮或其糖 苷、3’，7-二羟基-4’ -甲氧基-黄烷酮或其糖苷、3’，4’，7-三羟基-黄烷酮或其糖苷，其中黄烷酮就黄烷酮结构的2位而言可呈现为(S)-对映体、(R)-对映体、外消旋体或两种对映体的任意混合物。
[0021]在以下实例中提供了优先使用的多种黄烷酮:
[0022]
【权利要求】
1.一种使用转基因微生物生产二氢查耳酮尤其是根皮素的方法，其包括以下步骤:(i)提供转基因微生物，其包含-核酸区段(a)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，和-核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成；(?)将一种或更多种黄烷酮尤其是柚皮苷和/或所述黄烷酮的一种或更多种前体或者一种或更多种衍生物尤其是柚皮苷的前体或衍生物添加到所述转基因微生物中，以及在允许所述黄烷酮和/或其前体或衍生物尤其是柚皮苷和/或柚皮苷的前体或衍生物转化为二氢查耳酮尤其是根皮素的条件下培养所述转基因微生物；(iii)任选地:分离并且可能地纯化所述二氢查耳酮，尤其是根皮素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因微生物不是细枝真杆菌(Eubacteriumramulus),特别地不是梭菌(Clostridiales)目的微生物,更优选不是梭菌(Clostridia)纲的微生物，特别优选不是厚壁菌(Firmicutes)门的微生物；并且特别地选自兼性厌氧微生物，尤其是兼性需氧细菌，优选变形菌，尤其是肠细菌，例如埃希氏杆菌属，优选大肠杆菌(E.coli),尤其是大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌SEl ;和酵母,例如酿酒酵母(S.cerevesiae)和巴斯德毕赤酵母(P.pastor is)。
3.根据权利要求1或2所述·的方法，其中在步骤(ii)中添加柚皮苷和/或其糖苷配基。
4.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的查耳酮异构酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶，和/或编码植物查耳酮异构酶的所述基因编码来自拟南芥(A.thaliana)或紫花苜蓿(M.sativa)的查耳酮异构酶，和/或编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的烯醇还原酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一'I"生的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，和/或所述核酸区段(a，)包含根据SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，和/或所述核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95 %或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中 所述细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有40 %或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，和/或所述植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQID NO:8或SEQ ID NO:9有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成，和/或所述细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
7.转基因微生物，其包含核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成，以及核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述微生物具有查耳酮异构酶和烯醇还原酶活性，但是不具有根皮素水解酶活性。
9.根据权利要求7或8所述的微生物，其中所述微生物不是细枝真杆菌，特别地不是梭菌目的微生物，更优选不是梭菌纲的微生物，尤其优选不是厚壁菌门的微生物；并且特别地选自兼性厌氧微生物，尤其是兼性需氧细菌，优选变形菌，尤其是肠细菌，例如埃希氏杆菌属，优选大肠杆菌，尤其是大肠杆菌Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌SEl ;和酵母,例如酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的微生物，其中编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的查耳酮异构酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶，和/或编码植物查耳酮异构酶的所述基因编码来自拟南芥或紫花苜蓿的查耳酮异构酶，和/或编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的烯醇还原酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶；特别地，其中所述核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的核苷酸序列同一'I"生的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，和/或所述核酸区段(a，)包含根据SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成， 和/或 所述核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成； 和/或 所述细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成， 和/或 所述植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQID NO:8或SEQ ID NO:9有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成， 和/或 所述细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
11.载体，尤其是质粒载体，其包含 -核酸区段(a)和/或核酸区段(a’)，所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’ )包含编码植物查耳酮异构酶的基因或由其组成， 和/或 -核酸区段(b)，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
12.根据权利要求11所述的载体,其中 编码细菌查耳酮异构酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的查耳酮异构酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的查耳酮异构酶， 和/或 编码植物查耳酮异构酶的所述基因编码来自拟南芥或紫花苜蓿的查耳酮异构酶， 和/或 编码细菌烯醇还原酶的所述基因编码来自厚壁菌门，特别是梭菌纲，尤其是梭菌目的微生物的烯醇还原酶，尤其优选编码来自细枝真杆菌的烯醇还原酶； 特别地，其中 所述核酸区段(a)包含根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列或与SEQ ID NO:1有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的核苷酸序列同一'I"生的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成， 和/或 所述核酸区段(a，)包含根据SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的核苷酸序列或与SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7具有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成，和/或 所述核酸区段(b)包含根据SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的核苷酸序列或与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:5有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95%或更多的核苷酸序列同一性的核苷酸序列，或者由所述核苷酸序列组成； 和/或 所述细菌查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成， 和/或 所述植物查耳酮异构酶包含根据SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQID NO:8或SEQ ID NO:9有40%或更多，特别是50%或更多，60%或更多或80%或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成， 和/或 所述细菌烯醇还原酶包含根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4有40%或更多，特别是50 %或更多，60 %或更多或80 %或更多，尤其优选95 %或更多的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，或者由所述氨基酸序列组成。
13.宿主细胞，特别是根据权利要求7至10中任一项所述的微生物，其包含一种或更多种相同或不同的根据权利要求11或12所述的载体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其包含 具有核酸区段(a)和/或核酸区段(a’ )的一种或更多种载体以及具有核酸区段(b)的一种或更多种载体二者， 所述核酸区段(a)包含编码细菌查耳酮异构酶的基因或由其组成，所述核酸区段(a’)包含编码植物查耳酮异构酶之基因或由其组成，所述核酸区段(b)包含编码细菌烯醇还原酶的基因或由其组成。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微生物是根据权利要求13或14所述的微生物。
【文档编号】C12N15/81GK103571892SQ201310325521
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2012年7月31日
【发明者】延斯-迈克尔·希尔默, 埃贡·格罗斯, 格哈德·克拉默尔, 雅各布·彼得·莱伊, 梅希特希尔德·高尔, 乌韦·博恩朔伊尔, 马伦·汤姆森, 克里斯廷·彼得斯, 帕特里克·约恩齐克, 萨沙·博伊特尔, 托马斯·舍佩尔 申请人:西姆莱斯有限公司