水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻抗褐飞虱主效基因Bph14的基因标记及其应用，所述Bph14的基因标记Bph14-M1正反引物序列如下：正向引物为(5′-3′)AGCCACTTGGTGAACTTATT，反向引物(5′-3′)GATTGACGATGAGGAGACTT。所述应用方法包括1)提取水稻基因组DNA；使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA；电泳检测扩增产物。本发明通过该标记辅助选择，可以准确地将B5中的抗褐飞虱基因Bph14转育到褐飞虱敏感品种中去，极大地提高抗褐飞虱品种的选育效率。
【专利说明】水稻抗褐飞虱主效基因Bphl4的基因标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水稻品种的基因标记及其应用，具体涉及一种水稻抗褐飞虱主效基因Bphl4的基因标记及其应用。
【背景技术】
[0002]稻褐飞虱是危害水稻产量最严重的害虫之一，近十年来，我国褐飞虱连年爆发，平均每年造成水稻产量损失高达277万t。2010年农业部农作物重大病虫发生防治周报(第23期)报道，该年我国褐飞虱累计发生3.02亿亩次，严重威胁着水稻的高产和稳产。利用抗褐飞虱基因来培育抗褐飞虱品种，是控制稻褐飞虱危害最为经济有效和环境友好的途径。
[0003]国际水稻研究所自1973年利用常规手段,先后选育出一系列带有Bphl、Bph2和Bph3等抗褐飞虱主基因的水稻品种，但数年后随着褐飞虱新生物型的产生，这些品种的抗性都出现了退化。因此，发现并利用新的抗褐飞虱基因或聚合抗性基因，已成为控制褐飞虱危害的关键所在。
[0004]由于抗褐飞虱鉴定的复杂性，采用常规育种方法很难有效选育出抗虫品种，而利用与抗性基因紧密连锁或共分离的分子标记进行辅助选择，结合常规育种技术，则可以高效选择目的基因，培育抗虫品种。
[0005]迄今为止，水稻上报道了 26个抗褐飞虱主效基因，其中Bphl4被成功克隆，目前分子标记辅助选择育种中，对该基因的选择主要利用与之连锁的标记，如MRG2329、MRG2346、MRG2684、R1925和R2443等，而基因标记还未见报道，这在一定程度上影响了利用Bphl4进行抗褐飞虱育种过程中的选择效率和准确性。
【发明内容】
`[0006]本发明的目的是提供水稻品种B5抗褐飞虱主效基因Bphl4的基因标记及其应用，在分子标记辅助选择育种中提高选育效率。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
[0008]一种水稻抗褐飞虱主效基因Bphl4的基因标记BphH-Ml，其正反引物序列如下:
[0009]正向引物(5'-3' )AGCCACTTGGTGAACTTATT
[0010]反向引物(5'-3' )GATTGACGATGAGGAGACTT
[0011]本发明还公开了所述基因标记BphH-Ml的应用方法，包括:
[0012]1、提取水稻基因组DNA ;
[0013]2、使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA，具体操作为:PCR采用10μ L 反应体系:模板 DNA1.0 μ L，10XPCR Bufferl.0 μ L, 25mM 的 MgCl2L O μ L，2mM 的dNTPl.0μ L，0.3μΜ 的引物 1.0μ L, Taq 酶 0.2U，加 ddH20 补至 10 μ L ;PCR 扩增条件为:1)94°C预变性 5min ;2)94°C变性 30s，55。。退火 30s，72。。延伸 30s，扩增 32 个循环 3)72。。延伸5min, 16°C保温；
[0014]3、电泳检测扩增产物，如果出现307bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的抗褐飞虱基因Bphl4 ;如果出现432bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的褐飞虱敏感等位基因bphl4 ;如果有307bp和432bp两条带，则表示水稻品种为Bphl4/bphl4杂合体。
[0015]本发明的优点是:
[0016]I)本发明所获得的标记是根据Bphl4基因内部的碱基缺失设计的，为基因自身标记，故不存在遗传交换，不需要作表型鉴定。
[0017]2)本发明的标记为共显性标记，可鉴别Bphl4基因座位的杂合体和纯合体，实验
重复性好，结果可靠。
[0018]3)利用本发明的标记进行辅助选择育种，不仅节约成本，而且能够准确、高效地将抗褐飞虱品种B5中的Bphl4基因转育到褐飞虱敏感品种中去。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为Bphl4的部分序列(含第一内含子)在褐飞虱抗性品种B5和敏感品种Nipponbare (日本晴)间的比对。下划线箭头表示标记Bphl4_Ml的前后引物序列位置；虚线表示缺失的核苷酸序列。
[0020]图2为Bphl4的基因结构及标记BphH-Ml在基因中的位置。
[0021]图3为标记BphH-Ml对14个水稻品种的基因型检测结果。M为DNAmarker，I~14分别为:B5、93-11、桂朝2号、R7954、R402、R752、龙特甫B、中花11、日本晴、秀水63、02428、武育粳3号、宁恢8号、 Lemont。
【具体实施方式】
[0022]1、供试材料
【权利要求】
1.一种水稻抗揭飞風王效基因Bphl4的基因标记Bphl4-Ml,其正反引物序列如下: 正向引物(5' -3' )AGCCACTTGGTGAACTTATT, 反向引物(5' -3' )GATTGACGATGAGGAGACTT?
2.权利要求1所述基因标记BphH-Ml的应用方法，包括以下步骤: 1)提取水稻基因组DNA； 2)使用所述正反引物序列，PCR扩增水稻基因组DNA； 3)电泳检测扩增产物，如果出现307bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的抗褐飞虱基因Bphl4 ;如果出现432bp的单条带，则表示水稻品种含纯合的褐飞虱敏感等位基因bphl4 ;如果有307bp和432bp两条带，则表示水稻品种为Bphl4/bphl4杂合体。
3.如权利要求2所述的应用，其中，步骤2)中具体操作为:PCR采用10μ L反应体系:模板 DNA1.0yL, IOX PCR Bufferl.0 μ L，25mM 的 MgCl2L O μ L，2mM 的 dNTPl.0 μ L，0.3 μ M的引物1.0μ L，Taq酶0.2U，加ddH20补至10 μ L ;PCR扩增条件为:(1)94°C预变性5min ；(2)94°C变性 30s，55°C退火 30s，72。。延伸 30s，扩增 32 个循环；(3)72°C延伸 5min，16°C保温。`
【文档编号】C12N15/11GK103509791SQ201310325404
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】沈显华, 严松, 黄仁良, 沈林军, 熊宏亮, 朱珊 申请人:江西省农业科学院水稻研究所