高产l-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产l-丙氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸的方法。所述菌株为XZ-A26菌株，保藏号为CGMCC?No.4036，其具有发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌。本发明还涉及该菌株的构建方法及该菌株在制备L-丙氨酸中的应用。本发明通过代谢工程的方法，构建出能发酵生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌CGMCC?No.4036，利用该菌株发酵生产L-丙氨酸的产量高达115g/L，适合工业化生产L-丙氨酸。
【专利说明】高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸的方法
[0001]本中请是2011年8月17日递交的、名称为“一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用”的中国发明专利申请N0.201110235159.8的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株,属大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，该菌株于2010年7月26日保藏在位于“北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所”的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.4036。本发明还涉及该菌株的构建方法及该菌株在制备L-丙氨酸中的应用，属于生物工程【技术领域】。
【背景技术】
[0003]L-丙氨酸在食品和医药领域有着广泛的用途。在食品领域，L-丙氨酸的添加可明显提高食品及饮料中的蛋白质利用率，食用后能迅速恢复疲劳，振奋精神。L-丙氨酸可提高腌制品的腌制效果并改善风味，提高含醇饮料的质量等。L-丙氨酸具有独特的改善风味效果，它与其它氨基酸配合能加强食品、饮料风味。它还可以改善有机酸的酸味，添加后能使有机酸更接近天然果酸的酸味。在医药领域，L-丙氨酸是合成维生素B6的重要原料，同时也是营养剂补糖氨基酸营养输液的主要成分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液_《14氨基酸注射液-800》是主治肝脑病新药，可治疗肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒。L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。
[0004]目前L-丙氨酸的生产是以天门冬氨酸为原料，通过酶催化技术(天冬氨酸脱羧酶)来生产。由于天冬氨酸的生产是以顺酐为原料的，因此L-丙氨酸的生产成本及售价严重依赖于石油价格。 目前国内L-丙氨酸生产厂家均是使用酶催化技术。
[0005]微生物发酵法生产L-丙氨酸和酶催化技术相比有诸多优点:首先，用葡萄糖代替天冬氨酸作为生产原料。酶催化技术以天冬氨酸为原材料。目前天冬氨酸的生产是以顺酐为原料，顺酐的资源紧张和价格高涨导致天冬氨酸的供给也存在着巨大的隐患。微生物发酵法技术是以葡萄糖为原料。葡萄糖属于可再生生物质资源，目前主要是通过玉米淀粉制得，将来可以从木质纤维素中提炼，成本可以长期保持在稳定的水平。利用葡萄糖为原材料，既有很大的价格优势，又能长期维持价格的稳定。
[0006]其次，用微生物发酵法技术代替酶催化技术。酶催化技术需要对菌株进行高密度培养，分泌出生产L-丙氨酸所需的天冬氨酸脱羧酶。该过程对氧气的需求量很大；另外，由于天冬氨酸脱羧酶基因是克隆在质粒上进行高表达的，因此在菌株培养过程中，需要添加抗生素来维持质粒的稳定遗传复制。这些因素导致酶催化生产工艺复杂。微生物发酵法生产工艺简单，只需在起始阶段往发酵罐中投加葡萄糖和无机盐，并接入少量的菌种。另外，微生物发酵法和酶催化技术相比，其最终发酵液中杂质少很多，这既可以节约L-丙氨酸的分离提取成本，也可以节约废水处理的成本。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种通过生物发酵法生产高浓度L-丙氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)基因工程菌XZ-A26，该菌株保藏号为CGMCCN0.4036，其具有将糖类原料发酵产生高浓度L-丙氨酸的能力，其是通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌染色体上的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，再依次敲除所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因，然后在发酵罐中连续传代培养而得的基因工程菌(如附图1)。
[0008]本发明的另一个目的是提供上述菌株的构建方法，其包括下述步骤:
[0009](I)L-丙氨酸脱氢酶基因的整合:将大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶基因IdhA扩增并克隆到PEASY-Tl克隆载体上，得质粒pXZ-AOl ;将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ_A01的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ_A02 ；将质粒pXZ-A02的DNA扩增片段电转至带有PKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-AOl ;将扩增的L-丙氨酸脱氢酶基因连接至质粒pXZ-AOl的DNA片段，得到质粒PXZ-A03 ;然后将质粒PXZ-A03的DNA扩增片段电转至带有pKD46质粒的XZ-AOl，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A02 ；
[0010](2)依次敲除上述所得大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因；
[0011]丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除:将菌株XZ-A02的丙酮酸甲酸裂解酶基因扩增并克隆到pEASY-Tl克隆载体上，得质粒pXZ-A04 ;将含有卡那霉素基因Km和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB的DNA片段连接至质粒pXZ_A04的DNA扩增片段上，得到质粒pXZ_A05 ;将质粒PXZ-A05的DNA扩增片段电转至带有PKD46质粒的菌株XZ-A02，筛选卡那霉素抗性的菌落，得菌株XZ-A03 ;将质粒pXZ-A04的DNA扩增片段进行磷酸化处理后自连得到质粒pXZ_A06 ；然后将质粒PXZ-A06的DNA扩`增片段电转至带有PKD46质粒的XZ-A03，培养筛选在蔗糖中不能生长的菌落，得菌株XZ-A04 ；
[0012]乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除:按照丙酮酸甲酸裂解酶基因的敲除方法，分别以所得菌株XZ-A04、XZ-A06、XZ-A08和XZ-AlO为起始原料，进行乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因和丙氨酸消旋酶基因的敲除，分别得到菌株XZ-A06、XZ-A08、XZ-AlO和XZ-A12 ；
[0013](3)在发酵罐中连续传代培养步骤(2)所得菌XZ-A12得到菌株XZ-A26。
[0014]对大肠杆菌ATCC8739的代谢网络进行系统分析，设计出高效合成L-丙氨酸的策略。为了使细胞能够积累L-丙氨酸，需要进行三个方面的改造(如附图1):首先，需要引A L-丙氨酸脱氢酶基因。L-丙氨酸脱氢酶能够将丙酮酸转化为L-丙氨酸，同时消耗一个NADH。其次，需要敲除丙酮酸竞争途径基因。由于丙酮酸在大肠杆菌中是一个关键的中间代谢节点，因此需要将丙酮酸天然代谢途径失活，从而使代谢流全部转入L-丙氨酸的合成。这些竞争途径包括乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、乙醇脱氢酶基因、乙酸激酶基因、富马酸还原酶基因。第三，需要敲除L-丙氨酸降解途径基因。L-丙氨酸在大肠杆菌中能够被丙氨酸消旋酶转化为D-丙氨酸，这会大大降低L-丙氨酸的手性纯度。因此需要敲除丙氨酸消旋酶，避免D-丙氨酸的积累。
[0015]L-丙氨酸工程菌株的构建:[0016]根据上述的设计方案，在大肠杆菌ATCC8739的染色体上进行基因的敲除和整合。
[0017]首先，将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因整合在大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处，得到大肠杆菌XZ-A02。本发明所用到的序列如核苷酸序列表。
[0018]通过PCR扩增的方法，从嗜热脂肪地芽孢杆菌的基因组DNA中扩增出L-丙氨酸脱氢酶基因。所用引物为alaD-F/alaD-R(序列I和2)。为了使L-丙氨酸脱氢酶基因能够在工程菌中高效、稳定地表达，将其整合至大肠杆菌ATCC8739染色体的乳酸脱氢酶处。基因整合采用两步同源重组的方法(如附图2)。第一步,使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增大肠杆菌的乳酸脱氢酶基因(IdhA)，扩增产物包含乳酸脱氢酶编码基因及其上下游各500个碱基，并将其克隆到pEASY-Tl克隆载体(北京全式金生物技术有限公司)上，得到质粒pXZ-AOl。第二步，以pXZ-AOl质粒DNA为模板，使用引物ldhA-l/ldhA-2 (序列5和6)扩增出一段DNA片段，扩增产物包含pEASY-Tl载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游的500个左右碱基。第三步，将含有卡那霉素基因(Km)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A02。第四步，以pXZ_A02质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down(序列3和4)扩增出DNA片段I,用于第一次同源重组。首先将PKD46质粒转化至大肠杆菌ATCC8739，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的大肠杆菌ATCC8739，筛选卡那霉素抗性的菌落。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-AOl。第五步，将L-丙氨酸脱氢酶基因连接至第二步的PCR扩增产物，得到质粒pXZ-A03。第六步，以pXZ-A03质粒DNA为模板，使用引物ldhA-up/ldhA-down (序列3和4)扩增出DNA片段II，用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒转化至XZ-A01，然后将DNA片段II电转至带有pKD46的XZ-AOI，将其转移至含有10%蔗糖的LB液体培养基，培养24小时后在含有6%蔗糖的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-A02。本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒及构建如下表1。 [0019]表1:本发明的L-丙氨酸工程菌株的构建中所使用的质粒
[0020]
【权利要求】
1.一种能够发酵生产高浓度L丙氨酸的基因工程菌株，保藏号为CGMCC N0.4036。
2.通过生物发酵法生产L-丙氨酸的方法，其特征在于:采用厌氧培养条件，培养温度为30-42C，控制pH在6.5-7.5，在培养基中培养权利要求1所述的保藏号为CGMCC N0.4036的基因工程菌株，然后分离提取L-丙氨酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述培养基中糖类原料包括葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、木薯、玉米、甜菜、木质纤维素及其水解物和糖浆中的一种或多种；氮源为无机含氮化合物，包括氯化铵、乙酸铵、硫酸铵和磷酸铵中的一种或多种；微量无机盐包括可溶性的铁盐、钴盐、铜盐、锌盐、锰盐和钥酸盐中的一种或多种。
【文档编号】C12N1/21GK103602623SQ201310325533
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2011年8月17日 优先权日:2010年8月31日
【发明者】张学礼, 张冬竹 申请人:安徽华恒生物工程有限公司