一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于：在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN或OR)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25℃～40℃下搅拌反应，利用气相色谱方法（GC）检测反应进程，至反应转化率达到95%～100％时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)。本发明反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羟基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)的绿色生物制备方法。
【专利说明】一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物不对称合成领域，具体涉及一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法。
【背景技术】
[0002]他汀类药物是目前世界上最畅销的药物大类，它对胆固醇合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基辅酶A (HMG-CoA)还原酶具有强烈的抑制作用，可抑制胆固醇的合成，是治疗心血管疾病的重要药物，特别是阿托伐他汀和罗素伐他汀近些年都进入了全球最畅销药前十名。(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=Cl，CN或0R)是合成此类降胆固醇药物的关键手性中间体，可以通过化学法或生物法加以制备。目前国内主要通过化学法生产，化学还原方法的反应条件往往需要低温(如-70 V )，及易燃的硼烷类化合物参与，成本高，纯度低，污染尤其严重，对环境的影响非常大。相比较而言，生物法的反应条件温和，更加实用和环保。
[0003]目前生物法主要有酶法和全细胞催化两种。例如美国专利US2008/0248539公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮还原酶及其突变株还原法生产(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法利用外源添加的葡萄糖脱氢酶和辅酶因子来维持反应的进行，而且在反应中会产生葡萄糖酸，需用碱维持反应的PH，增加了操作程序，影响反应的原子经济性。国内专利CN 102978249公开了一种酮还原酶生产(3R, 5R)-6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法添加的是冻干酶粉，而且添加了价格昂贵的辅酶因子，成本较高，无法进行大规模产业化应用。国内专利CN 102643757公开了利用在土壤中筛选到的季也蒙毕赤酵母菌催化生产(3R，5R)-6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的方法，但天然菌株全细胞目的酶活低，杂酶种类多，催化存在着效率低，产物纯度不闻等不足。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种反应步骤简单、成本较低、产品纯度高，可大规模生产(3R，5S/R)-6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=C1，CN或0R)的绿色生物制备方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下:一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R) -6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯I (X=C1，CN或0R)、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法(GC)检测反应进程，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羟基己酸叔丁酯2 (X=C1, CN或0R)。
[0006]所述的含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为:将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD6tltl值达到0.8?1.2时，加入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
[0007]进一步地，所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，诱导终浓度为0.2?1.0mM，其中优选异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
[0008]进一步地，所述的水相缓冲液浓度为20?200mM，为三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH为6.0?8.0 ;其中更优选三乙醇胺缓冲液，pH6.5?7.5。
[0009]所述所述的水相缓冲液为50mM三乙醇胺缓冲液，其配置方法为:称取三乙醇胺7.45g, EDTA 1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至100ml。
[0010]进一步地，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R) -6-X-3-羟基_5_羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN或0R)的浓度为10%?30% (w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的10%?30% (w/w)，异丙醇的浓度为3%?12% (w/v)。根据一个优选方面，反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN or OR)的浓度为12%?20% (w/v)，反应中无需添加辅酶因子。
[0011]进一步地，在反应体系中加入的Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.5_20mM，不仅可以增加大肠杆菌细胞的通透性，而且这些离子还是酮还原酶的增强剂。其中更优选Ca2+，根据一个具体方面，所述的反应体系中所用的为CaCl2。
[0012]根据本发明，所用的底物(5S/R)-6-X_3-羟基_5_羰基己酸叔丁酯I (X=Cl，CN orOR)和其它使用到的原料均可商购获得。此外，本发明中所述的酮还原酶(KRED)基因的信息为公知，可通过市售购买获得。他人在实施本发明方法时可以按照本发明所述方法制备或购买。
[0013]由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势:本发明方法通过采用特定的重组酮还原酶，解决了传统生物法中催化效率低以及成本高的问题；且该方法反应不需破碎细胞，反应体系无需添加有机溶剂，条件温和，特别是，催化反应过程不用加还原性辅酶因子，降低了生产成本，仅利用细胞本身的辅酶再生体系，反应效率高、步骤少、简便易操作，大大提高了效率和降低了反应的成本，具有广阔的工业生产应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为重组大肠杆菌催化制备(3R，5S/R)-6-X-3, 5_ 二羟基己酸叔丁酯示意图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0016]以下实施例的反应缓冲溶液的配制均为:50mM三乙醇胺缓冲液(pH7.0)，称取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至1000ml。
[0017]实施例1重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养7小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于37°C下，摇床200rpm振荡培养，培养至0D_值达到
1.0时，加入0.5mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，于28°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
[0018]实施例2
从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30°C下，摇床180rpm振荡培养，培养至0D_值达到
0.8时，加入0.2 mM的乳糖，于22°C下继续培养20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
[0019]实施例3
从转化平板将含有酮还原酶(KRED)基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养4小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于38°C下，摇床220rpm振荡培养，培养至0D_值达到
1.2时，加入1.0 mM的异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，于32°C下继续培养16小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
[0020]实施例4利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法
在500mL三口烧瓶中依次加入50mM三乙醇胺缓冲液(ρΗ7.0) 240ml，所述的5OmM三乙醇胺缓冲液配置方法为:称取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至100ml ;然后依次加入12.5g异丙醇，42.3g底物(R)_6-氰基-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯，9.2g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，0.1Og无水CaCl2, 30°C下磁力搅拌开始计时反应，反应示意图如图1所示，16h取样，GC分析监测转化率99.2%，产物(3R，5R) -6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的立体构型纯度为99.7%，其中底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA), FID检测器。色谱柱温度120 °C，气化和检测温度均为280 °C，载气为N2。产物立体构型纯度的分析条件为:色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(3R, 5R) -6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯34.8g。
[0021]实施例5
在500mL三口烧瓶中依次加入50mM三乙醇胺缓冲液(pH7.0) 240ml，然后依次加入13.2g异丙醇,41.7g底物(S) -6-氯-3-轻基-5-羰基己酸叔丁酯,8.6g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.08g无水CaCl2, 30°C下磁力搅拌开始计时反应，反应示意图如图1所示，16h取样，GC分析监测转化率98.7%，产物(3R，5S) -6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯的立体构型纯度为99.5%，其中底物及产物的具体分析条件为:色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度120 °C，气化和检测温度均为280 °C，载气为N2。产物立体构型纯度的分析条件为:色谱柱为CP-Chirasil-DEX CB手性毛细管柱，其余条件同上。反应结束后，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并蒸发脱去溶剂，得到产物(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羟基己酸叔丁酯32.lg。
[0022]实施例6
实施例6与实施例4的区别在于，各物质的添加量分别为:7.2g异丙醇，24g底物
(S)-6-氯-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯，2.4g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.013g 无水 CaCl2。
[0023]实施例7
实施例7与实施例4的区别在于，各物质的添加量分别为:28.8g异丙醇，72g底物
(S)-6-氯-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯，21.6g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.53g无水CaCl2。
[0024]实施例8
实施例8与实施例4的区别在于，各物质的添加量分别为:16.7g异丙醇，48g底物
(S)-6-氯-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯，7.2g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.16g无水MgCl2。
[0025]实施例9
实施例9与实施例4的区别在于，各物质的添加量分别为:10.6g异丙醇，28.8g底物
(S)-6-氯-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯，7.2g实施例1所制备的重组酮还原酶的大肠杆菌细胞，0.04g无水CaCl2。
【权利要求】
1.一种利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯1、异丙醇、重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞，于温度25°C?40°C下搅拌反应，利用气相色谱方法检测反应进程，至反应转化率达到95%?100%时结束反应，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(3R，5S/R)-6-X-3, 5-二羟基己酸叔丁酯2 ;其中X=C1，CN或OR。
2.根据权利要求1所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的含有重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的制备方法为:将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养4?8小时，将培养得到的菌液接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，于30?38°C下，摇床180-220rpm振荡培养，培养至OD600值达到0.8?1.2时，加入诱导剂，于22?32°C下继续培养16?20小时，4°C下离心收集菌体，加入生理盐水清洗菌体2遍，再次离心收集菌体即得含有重组酮还原酶的大肠杆菌全细胞。
3.根据权利要求2所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的诱导剂为异丙基_β -D-硫代半乳糖苷或乳糖，诱导终浓度为0.2?1.0mM。
4.根据权利要求3所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求1所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的水相缓冲液浓度为20?200mM，为三乙醇胺缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH为6.0?8.0。
6.根据权利要求5所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的水相缓冲液浓度为PH6.5?7.5的三乙醇胺缓冲液。
7.根据权利要求6所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:所述的水相缓冲液为50mM三乙醇胺缓冲液，其配置方法为:称取三乙醇胺7.45g，EDTA1.48g，加去离子水700ml溶解后，加入浓HCl调pH至7.0，补加去离子水至1000ml。
8.据权利要求1-7任一项所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:反应起始时的反应体系中，底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯I的浓度为10%?30% (w/v)，重组酮还原酶的大肠杆菌细胞的用量为底物质量的10%?30% (w/w),异丙醇的浓度为3%?12% (W/V)，其中X=C1，CN或0R。
9.据权利要求8所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:底物(5S/R)-6-X-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯I的浓度为12%?20% (w/v)，其中X=Cl, CNor OR0
10.据权利要求9所述的利用全细胞催化制备他汀侧链中间体的方法，其特征在于:在反应体系中加入Ca2+、Mg2+等二价金属离子，浓度为0.5-20mM。
【文档编号】C12P7/62GK104342460SQ201310345732
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】陈令伟 申请人:南京朗恩生物科技有限公司