源于土曲霉的活性增强的酰基转移酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了与源自土曲霉的野生型酰基转移酶相比具有提高活性的酰基转移酶突变体。还提供了编码酰基转移酶突变体的多核苷酸、能表达所述突变体的宿主细胞及该酰基转移酶突变体的生产方法。可用于大规模合成重要的他汀类化合物辛伐他汀。
【专利说明】源于土曲霉的活性增强的酰基转移酶突变体
【技术领域】
[0001]本公开内容涉及用于生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。更具体的，本公开内容涉及比野生型酰基转移酶相比具有改进活性的非天然存在的酰基转移酶突变体、编码所述酰基转移酶突变体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的宿主细胞、所述酰基转移酶突变体的生产方法及使用所述酰基转移酶突变体生物催化生成辛伐他汀的方法和材料。
[0002]发明背景
辛伐他汀是Merck公司研制的降血脂药,商品名Zocor,辛伐他汀(simvastatin)是洛伐他汀的半合成衍生物，而洛伐他汀是分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物。辛伐他汀的药理作用是作为竞争性抑制剂抑制肝脏细胞内羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)活力，限制HMG-CoA向甲基二轻戍酸的转化,从而减少内源总胆固醇的生物合成总量。与相同剂量的洛伐他汀(1vastatin)、普伐他汀(pravastatin)和氟伐他汀(fluvastatin)等其他HMG-CoA还原酶抑制剂相比,辛伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。
[0003]1984年，Hoffman等发表了以洛伐他汀为起始原料，化学合成辛伐他汀的侧链水解路线，但该路线的副产物较多，因而给产物分离纯化带来不利影响。
[0004]1986年,Sleiteinger等发表了洛伐他汀的直接甲基化路线，该路线经Verhoeven(1989年)、Kumar (1998年)等修改提高，成为目前生产上使用最多的工艺，但直接甲基化路线需要多种昂贵及危险的化学试剂。
[0005]由于化学法合成过程条件苛刻，副反应多，产品分离纯化难度大，并因此造成目前制备辛伐他汀的成本较高。因此，极需一种能低成本高效率制备辛伐他汀和相关化合物的方法。
[0006]Xie等已从Aspergillus, terreus菌克隆获得酰基转移酶的编码基因并在E.coli中高表达。利用所得工程菌可以直接催化莫那克林J到辛伐他汀的转化，转化率达到99%。印度Ranganathan将不同来源的聚酮合成酶(PKS)功能域DNA序列组合成多种不同的洛伐他汀二酮合成酶基因，并在土曲霉(Aspergillus terreus)中表达,直接发酵产生辛伐他汀。
[0007]Xie等用丙氨酸残基或极性天然氨基酸替换Cys40和Cys60，显著提高酰基转移酶的可溶性表达。并且进一步实验证明这些突变具有可加性，其中C40A/C60N双突变体表现出溶解度和全细胞生物催化活性近50%的增长。
[0008]以上主要通过过表达酰基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌株作为全细胞生物催化剂，在单个发酵过程中合成制备量的辛伐他汀。以上研究证明酰基转移酶可用于辛伐他汀等重要的降低胆固醇药物的生物合成，是一种非常有吸引力的酶。然而，在使用分离的酰基转移酶进行的随后的实验中，稳定性和反应速率被证实是有问题的。具体来说，发现酰基转移酶在高蛋白浓度时容易沉淀，而在较低浓度时缓慢沉淀。此外，发现产物辛伐他汀会竞争酰基转移酶，显著地阻碍酰化的总净速率。
[0009]酰基转移酶在大肠杆菌中过表达时也高度倾向于错误折叠和聚集，使得对于工业规模生产来说即使是全细胞生物催化系统也不太理想。
[0010]朱丽平等在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达酰基转移酶，通过优化发酵条件，发酵培养基，接种量，诱导物浓度及诱导时间等，最后的酰基转移酶表达水平仅为100mg/L，辛伐他汀产量也仅为1.2g/L，远远达不到工业规模生产的要求。
【发明内容】
[0011]土曲霉(Aspergillus terreus)的LovD基因编码酰基转移酶,该酰基转移酶能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J(Monacolin J)转化为辛伐他汀。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酰基转移酶与土曲霉(Aspergillus terreus)产生的野生型酰基转移酶(SEQ ID N0:2)相比表现出增加的催化活性。“野生型酰基转移酶”、“野生型LovD酶”及“野生型LovD酰基转移酶”指由源自土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶基因SEQ ID NO:1编码的，并具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的酰基转移酶。该酶可以使用硫酯以区域专一的方式酰化的CS羟基基团以产生辛伐他汀。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指如在体外或体内试验中所测量的与野生型酰基转移酶相比，表现出使底物(例如莫纳可林J或其盐)向产物(例如辛伐他汀或其盐)转化率增加的酰基转移酶。
[0012]本发明提供了与野生型酰基转移酶相比具有提高活性的酰基转移酶突变体。还提供了编码酰基转移酶突变体的多核苷酸、能表达所述突变体的宿主细胞及该酰基转移酶突变体的生产方法。可用于大规模合成重要的他汀类化合物辛伐他汀。
[0013]本发明提供的源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，其特征在于，其是可用于辛伐他汀的发酵生产的酰基转移酶突变体，其中，突变是在亲本酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失I个或多个氨基酸，或者在亲本酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除I个或多个氨基酸，且与使用亲本酰基转移酶相比，其酰基转移酶活性增强2-50倍。
[0014]进一步地，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示:字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸:R28H，D96K，L174H, A178V, N191M, A261W, H404R。
[0015]所述的源于土曲霉(Aspergillus terreus)的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，能够使天然产物洛伐他汀的水解产物莫纳可林J(Monacolin J)转化为辛伐他汀。所述酰基转移酶突变体，与SEQ ID N0.2的野生型酰基转移酶相比表现出更强的催化活性。酰基转移酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。
[0016]进一步地，本发明提供一种源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体，包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。
[0017]全长突变的酰基转移酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酰基转移酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，I至20个氨基酸可以被删去。在另外的实施方案中，酰基转移酶突变体包括如下截短的蛋白质:其中从N-末端可以删去从I到20个氨基酸而从C-末端可以删去从I至20个氨基酸。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酰基转移酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酰基转移酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如SUMO蛋白)、纯化标签(如结合金属的His标签)和细菌定位信号(如分泌信号)的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。
[0018]进一步地，本发明提供上述的源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体的编码基因。
[0019]进一步地，本发明提供一种源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体的编码基因，其编码基因包含SEQ ID N0.3所述的DNA序列。其已经过密码子优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。
[0020]本发明提供一种重组质粒，其序列优选自SEQ ID N0.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacUV5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。
[0021]本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达酰基转移酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过重组工程使载体整合到基因组中。
[0022]本发明提供一种制备酰基转移酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤:(a)构建表达酰基转移酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及酰基转移酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备酰基转移酶突变体。
[0023]本发明提供一种生产辛伐他汀钠盐的方法，包括在酰基转移酶突变体的存在下，使莫纳可林J (Monacolin J)钠盐转化为辛伐他汀钠盐。本文描述的酰基转移酶突变体催化酰基基团从硫酯辅助底物到莫纳可林J(Monacolin J)及其类似物的转移以大量产生重要的他汀类化合物，例如辛伐他汀。在将莫纳可林J(Monacolin J)做为起始材料时，可以仅通过一步即可获得辛伐他汀。在酰基转移酶突变体使α-二甲基丁酰基团向莫纳可林J(Monacolin J)的C8位置转移的条件下,莫纳可林J(Monacolin J)底物(或其钠盐或铵盐)在DMB-S-MMP辅助底物的存在下与酰基转移酶突变体接触以产生辛伐他汀。α-二甲基丁酰底物可以使用市售的起始材料使用常规方法制备。莫纳可林J(Monacolin J)可以使用常规方法经过洛伐他汀的碱性水解获得。适合用于本文描述的酰基转移酶突变体的反应条件如下:40至100g/L的莫纳可林J(Monacolin J)钠盐底物；1.1-1.9当量的DMB-S-MMP辅助底物；1.5-6g/L的酰基转移酶突变体。反应温度在约20°C至30°C、而且通常不超过38°C的范围的温度下进行，这取决于所使用的酰基转移酶突变体的最佳催化温度，并且持续搅拌时间是约24至72小时。反应过程中可以通过HPLC高效液相分析等方式来检测转化率及副产物生成等。按照该反应，可以从最终反应产物中分离出辛伐他汀，并且进一步用标准程序将其转化为具有重要药效价值的盐类。
[0024]本发明的有益效果是:本发明的重组酰基转移酶具有明显的高比酶活，比野生型酰基转移酶提高了 2 - 50倍。该法利用酶法生物催化莫纳可林J(Monacc)Iin J)转化为辛伐他汀。此法反应条件温和，对设备要求极低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产辛伐他汀无副产物产生，纯化方便。反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，绿色环保。
【具体实施方式】
[0025]实施例1野生型及酰基转移酶突变体表达载体的构建
将来自土曲霉(Aspergillus terreus)的编码野生型酰基转移酶的多核苷酸(SEQ IDNO:1)根据菌株DHl密码子偏好性进行序列优化后(见Puigb6 P, Guzman E, Romeu A,Garcia-Vallve S.0PTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNAsequences.Nucleic Acids Res.2007),通过基于 PCR 的全基因合成方式(PCR-basedgene synthesis method)进行基因合成。将优化后的编码酰基转移酶的多核苷酸(SEQ IDNO:I)克隆到表达载体(SEQ ID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达野生型酰基转移酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物(已含有进行同源重组的同源臂)为:
F:5' TAACTTTTAGGAGGTAAAACATATGGGTTCTATCATCGACGCTGC 3’ ；
R:5’ TGGTGATGGTGATGCGATCCTCT TTAACCCTGCTGGTACTGAGCGTAG 3’。
[0026]用相同的方法将编码酰基转移酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO:3)克隆到表达载体(SEQ ID N0.5)的启动子的控制下，得到可以表达酰基转移酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DHl中。
[0027]实施例2酰基转移酶突变体的制备
挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DHl单菌落接种于1ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,磷酸氢二钠3.55 g/L,磷酸二氢钾3.4 g/L,氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L,灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。30°C, 250rpm过夜培养。次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到200ml高压灭菌后的培养基中:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30°C中培养至菌体OD 5_6，立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养Ih0加入IPTG至终浓度0.1mM,并于25°C，250rpm继续培养15h。
[0028]培养结束后，将培养液于4°C，6000g下离心20min最终得到湿菌体4.8g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4°C，12000g下离心30min，收集上清，预冷至_70°C后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.5g。
[0029]实施例3:辛伐他汀钠盐的催化合成
使用实施例2中描述所制备的酰基转移酶突变体，催化莫纳可林J(Monacolin J)钠盐生成辛伐他汀钠盐的具备实施步骤如下。向500mL的3颈圆底烧瓶装中加入1g莫纳可林J(Monacolin J)，然后加入50ml去离子水。用力搅动混合物直到溶解所有固体。然后加Λ 67ml TE缓冲溶液(pH 8.5)，并用浓HCl调整pH为9.0。加入0.2g酰基转移酶突变体粉末，立刻于25°C搅拌3分钟使酰基转移酶突变体粉末与液体混和均匀。加入DMB-S-MMP (7.1mL, 16.27mmol )，在25°C、350rpm条件下进行酶催化反应。取5 μ L反应混合物用甲醇稀释6倍后，于12000g下离心15分钟，以去除沉淀并且上清液用HPLC分析。结果显示在50h之后获得95%的转化率。
【权利要求】
1.源于土曲霉(Aspergillusterreus)的活性增强的酰基转移酶突变体，其特征在于，其是可用于辛伐他汀的发酵生产的酰基转移酶突变体，其中，突变是在亲本酰基转移酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在亲本酰基转移酶的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与使用亲本酰基转移酶相比，其酰基转移酶活性增强2-50倍。
2.根据权利要求1所述的源于土曲霉(Aspergillusterreus)的活性增强的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示:字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸:R28H，D96K，L174H, A178V, N191M, A261W, H404R。
3.根据权利要求2所述的源于土曲霉(Aspergillusterreus)的活性增强的酰基转移酶突变体，其特征在于，所述的突变体包含SEQ ID N0.4的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项所述源于土曲霉(Aspergillusterreus)的活性增强的酰基转移酶突变体的编码基因。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，其包含SEQID勵.3所述的0嫩序列。
6.含有权利要求4所述的编码基因的重组载体。
7.一种重组质粒，其特征在于:包含SEQ ID N0.5的序列。
8.含有权利要求6所述载体的宿主细胞。
9.权利要求1-3任一项所述源于土曲霉的野生型酰基转移酶的酰基转移酶突变体在生产辛伐他汀钠盐中的应用。
10.一种生产辛伐他汀钠盐的方法，其特征在于，所述方法以莫纳可林J钠盐为底物，在权利要求1-3任一项所述的突变体的催化作用下，得到辛伐他汀钠盐。
【文档编号】C12R1/66GK104342417SQ201310345811
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】丁雪峰 申请人:南京朗恩生物科技有限公司