一种脂肪酶催化在线合成6″-o-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂肪酶催化在线合成6″-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，所述方法为：以摩尔比为1:1～12的新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯为原料，以0.5～1.0g脂肪酶Lipozyme?RMIM为催化剂，以叔戊醇和DMSO的混合溶剂为反应溶剂，将脂肪酶Lipozyme?RMIM均匀填充在微流控通道反应器的反应通道中，所述微流控通道反应器的反应通道内径为0.8～2.4mm，反应通道长为0.5～1.0m；使原料和反应溶剂连续通入反应通道中进行酰化反应，控制酰化反应温度为40～55℃，酰化反应时间为20～40min，在线收集反应液，反应液经常规后处理得到6″-O-棕榈酰-新橙皮甙酯。本发明具有反应时间短、选择性高及产率高的优点。
【专利说明】一种脂肪酶催化在线合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脂肪酶催化在线可控选择性合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法。
(二)【背景技术】
[0002]新橙皮式(Neohesperidin)也叫新橙皮苷,是一种二氢黄酮类化合物,广泛存在于枳实、柑桔、柠檬、佛手等植物中，尤其在芸香科植物的果皮中含量较高。具有良好的抗癌、抑菌、抗氧化、降胆固醇、降低毛细血管脆性、改善微循环等多种生物活性，常用于医药、化妆品、食品等领域。
[0003]据研究黄酮类化合物的各种生物活性都是以抗氧化活性为基础的，与抗自由基或抗脂质过氧化有关。特殊的结构赋予它一系列独特的化学性质，如能与多种金属离子发生络合或静电作用，具有还原和捕获自由基的特性以及诸多衍生化反应活性等。黄酮类化合物抑制低密度脂蛋白LDL氧化和抑制类胡萝卜素及不饱和脂肪酸氧化的研究表明，苷元比糖苷具有更优秀的抗氧化活性。这是由于苷元亲脂性强，能嵌入生物膜疏水层的内核中发挥作用。黄酮苷类化合物的多羟基及糖基结构使其具有一定的亲水性，这势必会影响抗氧化活性。黄酮类化合物通过酯化修饰，在分子中引入长烃链可以增加它的脂溶性，从而增加和脂肪的相容性及提高抗氧化性。那么，新橙皮甙作为应用最多的黄酮类化合物之一，研究开发其生理活性更强的新橙皮甙脂肪酸酯必将具有良好的应用前景。
[0004]国外对于新橙皮苷的研究主要集中在提取、分离、鉴定及临床抗肿瘤等方面。国内对于新橙皮苷的研究主要集中在体外抑菌、体外抗氧化、降血酯等临床药理和保健功效方面。国内外对于新橙皮甙的改性应用这方面的研究并不多，主要是用化学的方法处理使其改性，就是使橙皮甙与某些金属离子螯和，以增强其生物活性；除此以外还有通过酶促反应法来改性，目的是提高其脂溶性以及耐热性。酶促改性由于反应条件温和、选择性较高等优点越来越被关注。目前，新橙皮甙通过酶促区域选择性酯化修饰，在分子中引入长烃链可以增加它的脂溶性，从而增加和脂肪的相容性及提高抗氧化性。虽然酶促反应有反应条件温和，选择性好的优点，但是酶催化反应也存在一些局限性，比如酶的活性与有机溶剂的极性之间的制约，有机溶剂的极性与反应底物的溶解性之间的制约，反应时间较长、转化率不高等技术瓶颈。因此， 寻找新橙皮甙酶促选择性酯化新技术对于发展新橙皮甙脂肪酸酯的生产具有重要意义。
[0005]微流控学(Microfluidics)是在微米级结构中操控纳升至皮升体积流体的技术与科学，是近十年来迅速崛起的新交叉学科。当前，微流控学的发展已大大超越了原来的主要为分析化学服务的目的，而正在成为整个化学学科、生命科学、仪器科学乃至信息科学新一轮创新研究的重要技术平台。
[0006]自1997年Harrison课题组发表了首篇在微流控芯片微反应器中合成化合物的文献后，微流控芯片反应器已成功地用于多种有机合成反应，并展示了广泛的应用前景。随着微流控芯片中微混合、微反应技术的发展，在芯片中进行合成反应已经成为微流控芯片领域的研究热点之一。
[0007]同常规化学反应器相比，微通道反应器不仅具有使反应物间的扩散距离大大缩短，而且传质速度快；反应物配比、温度、反应时间和流速等反应条件容易控制，副反应较少；需要反应物用量甚微，不但能减少昂贵、有毒、有害反应物的用量，反应过程中产生的环境污染物也极少，是一种环境友好、合成研究新物质的技术。
[0008]目前，有较多的国内外学者对有机介质中新橙皮甙酯的酶催化合成进行了研究，但是该方法往往需要较长的反应时间(24h)，且反应的转化率与选择性不高，利用微流控技术探索新的合成反应，用以解决现有合成方法的技术瓶颈是当今国际国内的研究热点。我们研究小组前期也对微流控反应器中糖类化合物的酶促选择性合成进行了系统研究，发现利用微流控技术进行糖类化合物的酶促选择性合成具有一定的可行性。而新橙皮甙是一类含糖黄酮类化合物，来源于枳实、柑桔、柠檬、佛手等植物中，具有良好的抗癌、抑菌、抗氧化、降胆固醇、降低毛细血管脆性、改善微循环等多种生物活性。对新橙皮甙的区域选择性酯化修饰不仅可以提高生物利用率，还可以拓展其在医药、食品等领域的应用。并且新橙皮甙是一类含糖黄酮类化合物，我们可以利用前期的研究基础对新橙皮甙的酶促区域选择性酯化进行研究。因此我们研究了微流控通道反应器中脂肪酶催化选择性合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，旨在寻找一种高效环保的新橙皮甙棕榈酸单酯的在线可控选择性合成方法，不同链长取代的新橙皮甙单酯，其溶解性，细胞渗透性等有很大不同，因而利用微流控技术合成不同链长取代的新橙皮甙单酯类化合物，可以深入研究其生物利用度，拓展其在医药和食品等领域的应用。
(三)
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是提供一种微流控通道反应器中脂肪酶催化选择性合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的新工艺，具有反应时间短、选择性高及产率高的优点。
[0010]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0011]一种脂肪酶催化在线合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，所述方法采用微流控通道反应器，所述的微流控通道反应器包括注射泵、注射器、反应通道和产物收集器，所述注射器安装于注射泵中，通过第一接口与反应通道的入口连通，所述产物收集器通过第二接口与反应通道的出口连通，所述反应通道内径为0.8~2.4_，反应通道长为0.5~
1.0m;所述方法包括:以物质的量之比为1:1~1:12的新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯为原料，以0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RMIM为催化剂，以叔戊醇和二甲亚砜(DMSO)的混合溶剂为反应溶剂，将脂肪酶Lipozyme RM頂均匀填充在反应通道中，将原料和反应溶剂置于注射器中，注射器在注射泵的推动下将原料和反应溶剂连续通入反应通道中进行酰化反应，控制酰化反应温度为40~55°C，酰化反应时间为20~40min，通过产物收集器在线收集反应液，反应液经后处理制得6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯。 [0012]本发明采用的微流控通道反应器中，所述注射器数目可以是一个或多个，视具体反应需求而定。比如，当使用两个注射器时，可采用T型或Y型接口与反应通道的入口相连通，使不同的反应物从两个入口引入，汇流进入公共的反应通道，通过微通道的中反应物分子接触与碰撞几率增大，使两股反应液流在公共的反应通道中混合并进行反应。注射泵将多个注射器同步进行推动。
[0013]所述的微流控通道反应器还包括恒温箱，所述的反应通道置于恒温箱中，例如恒温箱将反应通道封在箱内，以此可以有效控制反应温度。所述的恒温箱可以根据反应温度要求自行选择，比如水浴恒温箱等。
[0014]本发明对于反应通道的材质不限，推荐使用绿色、环保的材质，例如硅胶管；对于反应通道的形状最好为曲线形，可以保证反应液匀速稳定的通过。 [0015]本发明在实施过程中，可先用叔戊醇和DMSO的混合溶剂(叔戊醇:DMS0=4:1)溶解新橙皮甙，其用量只要保证新橙皮甙能充分溶解即可，并装于注射器中备用；仅用无毒的叔戊醇溶解棕榈酸乙烯酯，装于另一注射器中备用；然后在注射泵(例如PHD2000注射泵)的同步推动下使原料和反应溶剂通入反应通道中进行反应。因此，本发明中，反应溶剂中叔戊醇和DMSO体积比大于4:1，相比于常规的摇床反应，可以将有毒的DMSO的使用量降至最低。
[0016]较为优选的，本发明所述的方法包括下列步骤:
[0017]先用体积比为4:1的叔戊醇和DMSO的混合溶剂溶解新橙皮甙，装于注射器中备用；用叔戊醇溶解棕榈酸乙烯酯，装于另一注射器中备用；两支注射器通过Y型接口与反应通道的入口相连通，然后在注射泵的同步推动下将原料和反应溶剂通入反应通道中进行酰化反应。
[0018]当使用两个注射器分别向反应通道注入溶有新橙皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶液以及溶有棕榈酸乙烯酯的叔戊醇溶液时，用于溶解棕榈酸乙烯酯的叔戊醇的体积用量与溶解新橙皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶剂的体积用量优选是相等的，以便于保证进入反应通道时两种原料摩尔比的一致性。
[0019]所述用于溶解新橙皮甙的叔戊醇和DMSO的混合溶剂的体积用量通常以新橙皮甙的物质的量计为10~25mL/mmol。
[0020]本发明中，所述的脂肪酶Lipozyme RMIM使用诺维信(novozymes)公司生产的商品，是一种从Rhizomucor miehei得到的脂肪酶,是用一种基因改性的米曲霉(Aspergillusoryzae)微生物经过深层发酵而生产。Lipozyme RM IM是颗粒状产品,粒度为0.2_0.6mm。
[0021]本发明方法将脂肪酶Lipozyme RMM均匀填充在反应通道，通过机械方法直接将颗粒状的催化剂均匀固定于反应通道内即可。
[0022]进一步，所述新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯的摩尔比优选为1:8~10，最优选为1:8。
[0023]进一步，所述酰化反应温度优选为52~55°C，最优选为52 °C。
[0024]进一步，所述酰化反应时间优选为30~40min,最优选为35min。可通过调节注射泵来调节反应通道内流体的流速进而调节原料在反应通道内的停留时间，即反应时间。
[0025]本发明的反应产物可以在线收集，所得反应液可以通过常规后处理方法即可获得6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯。所述常规后处理方法可以是:所得反应液减压蒸馏除去溶剂，剩余物经硅胶柱层析分离，用200-300目硅胶湿法装柱，洗脱试剂为乙酸乙酯、甲醇、水体积比为25:2.5:0.6的混合溶剂，剩余物用少量洗脱试剂溶解后湿法上柱，收集洗脱液，同时TLC跟踪洗脱进程，将得到的含有单一产物的洗脱液合并蒸干，可以得到淡黄色的单酯晶体，即为6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯。
[0026]本发明使用的反应通道内径为2_，反应通道长为1.0m。反应通道内径和长度会影响反应通道内的流体流速及停留时间，但对反应本身不造成直接影响。
[0027]本发明中，虽然在新橙皮甙中有6个性能相近的羟基，但在微流控微通道反应器中脂肪酶催化选择性合成6 " -O-棕榈酰-新橙皮甙酯具有较高的转化率和选择性，二酯的转化率很低，几乎没有，通过柱层析分离得到的单酯的含量100%。产物的结构经1H NMR确证。这表明微流控微通道反应器中新橙皮甙棕榈酸酯的酶促选择性合成具有很好的反应转化率及选择性，能实现高的单酯化率。
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明微流控通道反应器中选择性合成新橙皮甙-6" -O-棕榈酸酯，该法不仅大大地缩短了反应时间，而且具有高的转化率和反应选择性；同时降低了 DMSO的使用量，具有环保优势。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例采用的微流控通道反应器的结构示意图。
(五)【具体实施方式】
[0030]下面以具体实施例对本发明的保护范围作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此:
[0031]本发明实施例使用的微流控通道反应器的结构参考图1，包括一个注射泵(未显示)、两个注射器1、反应通道3、水浴恒温箱(5，仅显示其平面示意图)和产物收集器4 ;两个注射器I安装于注射泵中，通过一个Y型接口与反应通道3的入口连通，所述反应通道3置于水浴恒温箱5中，通过水浴恒温箱5控制反应温度，所述的反应通道3的内径2.0mm,管长lm，所述反应通道3的出口通过第二接口与产物收集器4连通。
[0032]实施例1:6 " -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的合成
[0033]
【权利要求】
1.一种脂肪酶催化在线合成6" -O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于所述方法采用微流控通道反应器，所述的微流控通道反应器包括注射泵、注射器、反应通道和产物收集器，所述注射器安装于注射泵中，通过第一接口与反应通道的入口连通，所述产物收集器通过第二接口与反应通道的出口连通，所述反应通道内径为0.8~2.4_，反应通道长为0.5~1.0m ;所述方法包括:以物质的量之比为1:1~12的新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯为原料，以0.5~1.0g脂肪酶Lipozyme RM頂为催化剂，以叔戊醇和二甲亚砜的混合溶剂为反应溶剂，将脂肪酶Lipozyme RM頂均匀填充在反应通道中，将原料和反应溶剂置于注射器中，注射器在注射泵的推动下将原料和反应溶剂连续通入反应通道中进行酰化反应，控制酰化反应温度为40~55°C，酰化反应时间为20~40min，通过产物收集器在线收集反应液，反应液经后处理制得6 " -O-棕榈酰-新橙皮甙酯。
2.如权利要求1所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述的方法包括下列步骤:先用体积比为4:1的叔戊醇和DMSO的混合溶剂溶解新橙皮甙，装于注射器中备用；用叔戊醇溶解棕榈酸乙烯酯，装于另一注射器中备用；两支注射器通过Y型接口与反应通道的入口相连通，然后在注射泵的同步推动下将原料和反应溶剂通入反应通道中进行酰化反应。
3.如权利要求1所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反应器包括恒温箱，所述反应通道置于恒温箱中。
4.如权利要求2所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述微流控通道反应器包括恒温箱，所述反应通道置于恒温箱中。
5.如权利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯的物质的量之比为1:8~10。
6.如权利要求1~4之一所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述酰化反应温度为52~55°C，所述酰化反应时间为30~40min。
7.如权利要求5所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述新橙皮甙与棕榈酸乙烯酯的物质的量之比为1:8。
8.如权利要求6所述的脂肪酶催化在线合成6"-O-棕榈酰-新橙皮甙酯的方法，其特征在于:所述酰化反应温度为52°C，所述酰化反应时间为35min。
【文档编号】C12P19/60GK103667399SQ201310392283
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】杜理华, 罗锡平, 凌慧敏, 何锋, 杨文俊 申请人:浙江工业大学