Pcr直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法。该引物包括：上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT；下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。所述方法包括：提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA；以cDNA为模板，利用引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序；基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树；根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。利用该引物只进行一次PCR扩增即可获得汉坦病毒S基因的特异性序列，利用该特异性序列能简便快速地对汉坦病毒进行基因分型。
【专利说明】PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因诊断【技术领域】，尤其涉及一种PCR直接测序法对汉坦病毒进行基因分型的引物及试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]汉坦病毒(Hanta virus，HV)属布尼亚病毒科的汉坦病毒属是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，包括引起汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)的汉坦型、汉城型、普马拉型等，以及引起汉坦病毒肺综合征(HPS)的纽约型、无名型等，在我国以汉坦型和汉城型为主要流行株。汉坦病毒的自然宿主主要是小型啮齿动物，并经由啮齿类动物传播给人类，引起HFRS 或 HPS 等。
[0003]汉坦病毒感染又称出血热，是重要的烈性人兽共患病原，被国家国卫生部和农业部列为二类危害病原。实验动物高度易感，近年来，实验动物汉坦病毒感染人事件的频发已成为危害科研人员健康和实验动物业发展的重要因素。
[0004]自上世纪60年代到90年代先后发生30余起实验室内大鼠感染流行性出血热事件，共导致50余名科研人员发病。2000~2001年间，在对杭州市多家科研和教学单位的实验动物相关工作人员血清人兽共患病病原抗体的检测中发现，家鼠型肾综合征出血热病毒和弓形虫抗体均有阳性病例，表明实验动物密切接触者时刻存在着感染人兽共患病病原风险。
[0005]从事实验动物大小鼠生产及科学研究人员由于经常接触携带HV的宿主动物及其排泄物、污染的尘埃等而受感染，由于汉坦病毒引发疾病的类型及其严重程度取决于病毒的型别，对汉坦病毒株的分型 ，以及阐明病毒之间的关系对汉坦病毒病原防治具有重要的意义。
[0006]采用血清学方法虽然能对病毒进行分类，但血清学分型的实验周期长，工作量大，得到病毒分离物较为困难无法进行血清学分型，而且不能阐明病毒之间的系统发生关系。基于病毒基因的序列数据分析不但能对病毒进行基因分型，还能较好地阐明病毒之间的系统发生关系。
[0007]已有研究表明，依据M基因片段和S基因片段的全长核苷酸序列构建系统发生树，对汉坦病毒进行基因分型的结果与血清学分型结果一致，但需对整个基因进行全核苷酸测序分析，目前尚无文献报道仅用一次PCR产物的直接测序结果实现汉坦病毒不同毒株的基因分型。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一对引物，利用该引物可以一次特异性扩增汉坦病毒S片段的目标序列，利用该目标序列能准确对汉坦病毒进行基因分型。
[0009]一对引物，包括:[0010]上游弓I 物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT ；
[0011]下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA；
[0012]其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。
[0013]该引物是基于Genbank上公开的24株汉坦病毒代表株的S基因片段序列设计的，利用该引物只需进行一次PCR扩增，获得的扩增产物即可用于对待测病毒样本的基因分型。
[0014]具体地，利用所述引物对汉坦病毒进行基因分型的方法包括：
[0015](I)提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA ；
[0016](2 )以所述cDNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序;
[0017](3)基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树；
[0018](4)根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。
[0019]为保证测序数据的准确性，作为优选，步骤（2)中，采用双向测序法对扩增的目的片段进行测序，测序完成后进行序列拼接。目的片段的长度在200bp左右，单向测序可完全测通但只有一次覆盖，若采用的双向测序法进行测序，则每个扩增产物即可有两次覆盖。测序完成后对双向测序得到的两条序列进行合并，即得到一条高质量序列。
[0020]作为优选，步骤（3)中，利用邻位相连法构建系统发生树。邻位相连法（NJ法）通过确定距离最近的成对分类单位使系统发生树的总距离达到最小，通过循序地将相邻点合并成新的点，从而建立起一个相应的拓扑树。与其他方法相比，利用邻位相连法构建的系统发生树，其基因分型结果更为准确。
[0021]所述已知基因型代表毒株包括株号为76-118、A16、Cl_2、NC167、Z10、Gou3、K24-V2、L99、R22、SR11、160V、Dobrava, Cg-13891、Cg-Erft、K27、Vranica、AHl、C9717869、0f22819、Bayou、NMH10、NMRlU CC74和CC107的汉坦病毒。这24株汉坦病毒代表毒株的基因序列索引号依次是：M14626、AF288646、D25533、AB027523、AF184987、AF184988、AF288655、AF488708、AF488707、M34881、AJ009773, L41916、U22423、AJ238779, L08804、U14137、AF324902、NC_003466、AF482714、L36929、L25784、L37904、L33816、L33683，涵盖了7种汉坦病毒血清型。在利用本发明引物进行扩增的基础上，以这些代表毒株为参照构建系统发生树能够准确地获得待测病毒样本的系统分类位置。
[0022]在利用多条序列进行系统发育分析前，还需对这些序列进行联配，对它们的序列相似性进行评估，为后期分析提供信息位点。
[0023]本发明还提供了一种用于汉坦病毒基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTP液、MgCl2溶液、Taq酶、阴性对照、阳性对照和去离子水，以及上述引物。其中，MgCl2溶液的浓度为25mM，dNTP液的浓度为10mM。
[0024]作为优选，所述试剂盒还包括核酸提取液和胶回收提取液。如此一来，利用该试剂盒即可完成对病毒样本进行核酸提取、反转录、PCR扩增、胶回收纯化的一系列步骤，不必再另外使用其他的核酸提取试剂盒以及胶回收试剂盒。
[0025]本发明仅针对汉坦病毒S基因特定片段设计单一引物，该引物经Genbank中24株汉坦病毒代表性毒株序列的比对验证，结果表明该序列能实现对汉坦病毒不同基因型的分型鉴定。此外，对9株流行性毒株进行PCR-直接测序，并与上述24株汉坦病毒代表性毒株共同构建系统发生数，其结果与血清学分型一致，表明该方法具备一次PCR实现汉坦病毒基因分型的能力。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0027]利用本发明设计的引物和试剂盒只需进行一次PCR扩增即可获得汉坦病毒S基因的特异性序列，利用该特异性序列能简便快速地对汉坦病毒进行基因分型。
[0028]说明书附图
[0029]图I为各病毒样本的PCR产物电泳图；其中，M为DNA分子量标准，1_4分别为肺440、肺473、471、97阴性对照的PCR产物，5、7_11、T8、NI~4分别为天77-2、游10-31、泉547、龙泉、游 10-30、R88、T8&N1、N2、N3、N4 的 PCR 产物；
[0030]图2为24株汉坦病毒代表株S片段引物设计区基因的分型结果；
[0031 ] 图3为24株汉坦病毒代表株和11株实验毒株S片段引物设计区基因的分型结果。
【具体实施方式】
[0032]一、主要试剂
[0033]RNA提取试剂盒Rneasy Mini Kit购自Qiagen公司；克隆载体、T4连接酶、M-MLV逆转录酶、DNA Taq酶、聚合酶链式反应（PCR)相关试剂、琼脂糖凝胶纯化试剂盒及质粒DNA纯化试剂盒购自日本TaKaRa中国分公司。
[0034]二、引物设计
[0035]从Genbank数据库中下载24株汉坦病毒代表性毒株的基因序列，这24株病毒代表株包括7种血清亚型，详细信息见表1。
[0036]表124株汉坦病毒代表性毒株的信息
【权利要求】
1.一对引物，包括： 上游引物：ATTAGCCCWGTCATGAGTGT ； 下游引物：CTTTGACTCYTTTGKYTCCA ； 其中Y为C或T，W为A或T，K为G或T。
2.利用权利要求1所述引物对汉坦病毒进行基因分型的方法，包括： (1)提取待测病毒样本的总RNA，逆转录获得cDNA； (2)以所述cDNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增，并对扩增的目的片段进行测序； (3)基于目的片段的序列信息并以已知基因型代表毒株的相应片段为参照构建系统发生树； (4 )根据系统发生树对待测病毒样本进行基因分型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，采用双向测序法对扩增的目的片段进行测序，测序完成后进行序列拼接。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3)中，利用邻位相连法构建系统发生树。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述已知基因型代表毒株包括株号为76-118、A16、Cl-2、NC16 7、Z10、Gou3、K24-V2、L99、R22、SR11、160V、Dobrava, Cg-13891、Cg-Erft、K27、Vranica、AH1、C9717869、0f22819、Bayou、NMHlO、NMRlI、CC74 和 CC107 的汉坦病毒。
6.一种用于汉坦病毒基因分型的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTP液、MgCl2溶液、Taq酶、引物、阴性对照、阳性对照和去离子水，其特征在于，所述引物为权利要求1所述的引物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，MgCl2溶液的浓度为25mM，dNTP液的浓度为 10mM。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取液和胶回收提取液。
【文档编号】C12R1/93GK103484566SQ201310413527
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】戴方伟, 宋晓明, 周莎桑, 卢领群, 萨晓婴 申请人:浙江省医学科学院