一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法
【专利摘要】本发明涉及一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法。剪取成年猪皮肤，去除毛发、脂肪和污垢后于75%酒精浸泡，用PBS清洗后剪成小块，0.25%Trypsin中4℃消化过夜；皮肤块经DMEM高糖培养液清洗，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化、吹打后过400目细胞筛得到细胞悬液，转入猪皮肤干细胞培养液培养；原代培养3-4天的成年猪皮肤经PBS清洗，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA润洗、消化，轻敲平皿侧壁使细胞脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，离心后弃上清将细胞重悬后传代。本发明方法操作简便，可重复性好，培养的成年猪干细胞表达β1-integrin和Nestin等皮肤干细胞特异蛋白，并且是碱性磷酸酶阳性。
【专利说明】一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法
【技术领域】:[0001]本发明涉及一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstem cell, ESC)和成体干细胞(somatic stem cell)。胚胎干细胞具有发育的全能性,但是它只存在于胚胎发育早期，因此其获得性以及伦理问题限制其进一步的研究及应用。
[0003]成体干细胞虽然没有胚胎干细胞发育全能性方面的优势，但是其取材方便，来源广泛，并且仍保留向多种细胞类型分化，因此成体干细胞的体外培养以及功能研究成为近年来研究的热点。皮肤干细胞是成体干细胞的一种，是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能干细胞。这种细胞聚居于皮肤组织的基底层以及毛囊等部位，一旦需要，便可按特定发育途径分化产生出另外一群具有有限分裂能力的细胞群，是表皮、皮脂腺和毛囊细胞更新和修复的细胞来源。对皮肤干细胞的研究有助于皮肤组织再生，毛囊及附属器官再生及治疗脱发以及畜牧业生产具有重要意义。
[0004]成年猪皮肤外侧被覆坚硬毛发，内侧则密布脂肪及结缔组织，干细胞数量有限，因此其体外分离培养有一定的难度，并且目前国内外研究中由于对组织内成体皮肤干细胞缺乏有效的分离培养方法，阻碍了该领域研究的深入发展。如何高效获得具有良好生物学性能的干细胞，是目前成体干细胞研究急需解决的问题。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种成年猪皮肤干细胞(PorcineSkin-Derived Stem Cells)体外高效分离培养的技术方法。本发明方法分离成年猪皮肤，剪掉外侧毛发并分离内侧脂肪，将皮肤块剪碎消化吹打为单细胞并过400目细胞筛后，体外培养成年猪皮肤干细胞，成功获得大量状态良好的成年猪皮肤干细胞。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明方法按照如下步骤操作:第一步，成年猪皮肤分离与清洗:剪取成年猪皮肤，剪掉皮肤外侧毛发，并用弯角镊刮掉毛孔中污垢，将皮下脂肪及结缔组织剪干净，于75%酒精浸泡5分钟进行灭菌处理，磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)清洗三次除去残留酒精，将皮肤剪成2-3mm2小块，置于0.25%Trypsin中4°C消化过夜以使皮肤变得松散；第二步，原代培养成年猪皮肤干细胞:皮肤块经DMEM/F12(细胞培养液Dulbecco’ sModified Eagle Medium, F_12Nutrient Mixture)清洗，置于 0.25%Trypsin_0.04%EDTA,37 °C消化30分钟，移液器吹打皮肤块，轻轻吹打混匀后加入10%胎牛血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，将细胞悬液过400目细胞筛，细胞悬液转入皮肤干细胞培养液培养，以培养当天为原代，每3-4天传代一次；第三步，传代培养:原代培养3-4天的成年猪皮肤经磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)洗两遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA润洗，之后加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA置于37°C消化10分钟，轻敲平皿侧壁使细胞从皿底脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，1000转/秒离心5分钟后弃掉上清液，加入新鲜皮肤干细胞培养液将细胞重悬按照I板细胞传代为2板或者3板细胞的比例进行传代。
[0007]本发明方法第二步所述皮肤干细胞培养液为DMEM/F12 ; 10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1%青链霉素。
[0008]本发明方法建立了成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法，从有限的材料来源获得大量的成体动物的皮肤干细胞，操作简便，可重复性好，为成体猪皮肤干细胞体外培养及研究应用提供了技术基础。
【专利附图】
【附图说明】:
[0009]图1为成年猪皮肤干细胞体外培养显微图。
[0010]图2为成年猪皮肤干细胞体外增殖生长曲线图。
[0011]图3为成年猪皮肤干细胞的碱性磷酸酶染色图。
[0012]图4为成年猪皮肤干细胞进行免疫荧光组织化学染色图。
【具体实施方式】:
[0013]下面通过附图和具体实施例对本发明方法做进一步阐述。
[0014]实施例1、成年猪皮肤干细胞的体外分离培养
[0015]本方法中皮肤干细胞(SDSCs)来自于成年猪皮肤。
[0016]第一步，成年猪皮肤分离与清洗:剪取出栏成年母猪背部、肚皮部等部位的皮肤，剪掉皮肤外侧毛发，并用弯角镊刮掉毛孔中污垢，将皮下脂肪及结缔组织尽量剪干净，于75%酒精浸泡5分钟进行灭菌处理，磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.0)清洗三次除去残留酒精，将皮肤剪成2-3mm2小块，置于0.25%Trypsin (Hyclone公司)中4°C消化过夜以使皮肤变得松散；
[0017]第二步，原代培养成年猪皮肤干细胞:皮肤块经DMEM/F12(Hycl0ne公司)清洗3遍后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)，37°C消化30分钟，移液器吹打皮肤块，轻轻吹打混匀后加入10%胎牛血清终止消化，于DMEM/F12 (Hyclone公司)中洗I遍，将细胞悬液过400目细胞筛后转入成体皮肤干细胞培养液培养，皮肤干细胞培养液为DMEM/F12(Hyclone公司);10%胎牛血清；2%B27 (Gibco公司)；20ng/ml表皮生长因子(EGF，Sigma公司)；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, Peprotech公司)；1%青链霉素(Hyclone公司)，以培养当天为零代，每4天传代一次。图1所示为成年猪皮肤干细胞体外培养显微图。图1中I为过细胞筛后单细胞悬液，培养I天后细胞数目增多并开始贴壁(图1中2)，传代I次后成年猪皮肤干细胞完全铺贴壁并铺展开，呈上皮样细胞贴壁状态(图1中3)。
[0018]第三步，传代培养:将不同传代次数的成年猪皮肤干细胞经pH7.0的PBS洗两遍，加入 0.5ml0.25%Trypsin_0.049f)EDTA (Hyclone 公司)润洗，之后加入
1.5ml0.25%Trypsin-0.04%EDTA (Hyclone公司)置于37°C消化10分钟，轻敲平皿侧壁使细胞从皿底脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，1000转/秒离心5分钟后弃掉上清液，加入新鲜皮肤干细胞培养液将细胞重悬按照I板细胞传代为2板或者3板细胞的比例进行传代。在传代过程中进行细胞计数。传代培养1-5代成年猪皮肤干细胞数分别为:1.2X104、2.3Χ104、5.3Χ104、7.2Χ104、10.I X 10Vml0
[0019]绘制成年猪皮肤干细胞体外增殖生长曲线，得到成年猪皮肤干细胞体外增殖生长曲线如图2所示，横坐标表示成年猪皮肤干细胞传代次数，纵坐标表示成年猪皮肤干细胞传代过程中每代细胞数(I X 104)。
[0020]实施例2、成年猪皮肤干细胞的碱性磷酸酶染色
[0021]将成年猪皮肤干细胞在PBS中洗3次后，置于4%多聚甲醛(索莱宝公司)室温固定15分钟，同时按如下方式配置磷酸酶染色工作液:
[0022]
?性色缓冲液(鈣云天公司)3 ml
BCIP灌液(300X,碧云天公司)10 μ?
NBT 潘液(150Χ, S 云天公-> ?J)20 μ?
BCIP/NBT 染色 J '.作液3.03 ιιι!
[0023]固定结束后，PBS洗涤3次，最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral redstaining solution)染色，以便于观察。图3为成年猪皮肤干细胞的碱性磷酸酶染色，显示成年猪皮肤干细胞为碱性磷酸酶阳性(蓝紫色)。
[0024]实施例3、细胞免疫荧光化学分析成年猪皮肤干细胞特定基因表达
[0025]取出传代两次成年猪皮肤干细胞，消化为单细胞后，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛(索来宝公司)室温固定15分钟。或PBS洗3遍，每遍5分钟。用PBST(PBS+0.5%Tr it ion-100)溶液进行透化，室温10分钟。PBS (磷酸盐缓冲液，pH7.0)洗I遍，5分钟。加入含10%山羊血清或马血清(索来宝公司)的PBST(PBS+0.5%Trition-100)，室温封闭30 — 60分钟。弃封闭液，加入一抗(I: 200, abeam公司)稀释于封闭液中，4°C过夜或37°C孵育2小时。I %BSA (牛血清白蛋白，索莱宝公司)的PBS洗3遍,每遍5分钟。加入二抗(1:200,碧云天公司)稀释于二抗稀释液中，37°C避光放置I小时。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入终浓度的DAPI (碧云天公司)，室温放置5分钟。PBS洗3遍，每遍5分钟。加入500μ1 PBS或PBS甘油(1:1)在荧光显微镜下拍照或避光保存。图4中1-3说明SDSCs呈β rintegrin阳性并在细胞质表达，图4中4-6说明SDSCs呈Nestin阳性并在细胞质表达。
【权利要求】
1.一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作:第一步，成年猪皮肤组织分离与清洗:剪取成年猪皮肤，剪掉皮肤外侧毛发，并刮掉毛孔中污垢，将皮下脂肪及结缔组织剪干净，于75%酒精浸泡进行灭菌处理，PH7.0磷酸盐缓冲液清洗除去残留酒精，将皮肤剪成2-3mm2小块，置于0.25%Trypsin中4°C消化过夜以使皮肤变得松散；第二步，原代培养成年猪皮肤干细胞:皮肤块经DMEM/F12清洗，置于0.25%Trypsin-0.0496EDTA，37°C消化30分钟，移液器吹打皮肤块，轻轻吹打混匀后加入10%胎牛血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，并将细胞悬液过400目细胞筛，细胞悬液转入皮肤干细胞培养液培养，以培养当天为原代，每3-4天传代一次；第三步，传代培养:原代培养3-4天的成年猪皮肤干细胞经pH7.0磷酸盐缓冲液洗两遍，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA润洗，之后加入0.25%Trypsin-0.0496EDTA置于37°C消化10分钟，轻敲平皿侧壁使细胞从皿底脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，1000转/秒离心后弃掉上清液，加入新鲜皮肤干细胞培养液将细胞重悬按照I板细胞传代为2板或者3板细胞的比例进行传代；其中，所述皮肤干细胞培养液为DMEM/F12 ;10%胎牛血清；2%B27 ；20ng/ml表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1%青链霉素。
2.根据权利要求1所述的一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法，其特征在于培养的成年 猪干细胞表达β fintegrin和Nestin皮肤干细胞特异蛋白，并且是碱性磷酸酶阳性。
【文档编号】C12N5/071GK103468637SQ201310445509
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】孙源超, 王俊杰, 葛伟, 李兰, 沈伟 申请人:青岛农业大学