蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体的茎部分离获得，分类命名为(Peyronellaea?glomerata)HS-ZJUT-XW12，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC?NO：M?2012434。本发明提供的菌株，是本发明人经多年创造性实验劳动发现的菌株，首次用该菌株发酵培养，制备具有护肝活性的化合物FPBA；该制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、工艺步骤少、生产周期短等优势，具有工业化规模生产的潜力；为寻找开发吡咯类护肝药的来源提供了新途径，可在一定程度上缓解临床用药短缺的局面。
【专利说明】蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，具体涉及一种蛇足石杉内生真菌及其在制备吡咯类护肝药中的应用，即涉及一种微生物发酵法制备吡咯类护肝药的应用。
【背景技术】
[0002]目前，病毒性肝炎、酒精及药物中毒性肝病、各种肝损伤以及随之而来的肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭等疾病，已严重危害人类健康，且危害程度正在日益升级。恰当、有效地遴选护肝药物，不仅可迅速改善病人的临床症状与预后，且可为进一步的病因治疗奠定基础。尽管近年国内外相继开发了许多新一代保肝药物及其疗法，但至今仍然缺少低毒、高效的肝病防治药物。
[0003]天然产物作为药物先导化合物的丰富来源，近年来在新药发现中的地位和作用不断提升。部分天然产物表现出了抗病毒、改善和恢复肝功能、调节免疫以及抗肝纤维化等疗效，因此，从天然产物中寻找护肝药物是新药开发研究的重要途径之一。
[0004]有学者研究发现，来源于药用植物枸杞子和东北土当归的吡咯衍生物类天然产物4-[Formy 1-5- (methoxymethyl) -ΙΗ-pyrrol-l-yl]butanoic acid (简称FPBA),具有显著的
护肝活性，且由于从药用植物中提取分离而来，故该化合物毒性较低；因此可用于开发成一
种低毒、高效的护肝药物。FPBA的分子式为C11H15O4N,结构式如下所示
【权利要求】
1.一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体的茎部分离获得，其分类命名为(Peyronellaea glomerata)HS-ZJUT-XW12,该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年10月28日，保藏编号为CCTCC M2012434，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
2.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的ITS碱基序列为:
3.根据权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，菌株的固体培养为:在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，于28°C下培养，菌丝呈白色絮状，生长较缓慢、与培养基结合紧密；培养4~7天，菌落即铺满整皿，菌落呈土灰色、干燥、不透明、边缘不平整，背面呈浅黄色。
4.根据权利要求3所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，通过如下方法制得:取200g马铃薯去皮、切块后，加IL水煮沸约30分钟，双层纱布过滤，取滤液加20g葡萄糖、18g琼脂溶解后，加水补足1L。
5.一种用如权利要求1~4所述的蛇足石杉内生真菌制备吡咯类护肝化合物的方法，包括如下步骤:` (1)挑取菌丝体接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28°C培养，使菌株活化； (2)将活化好的菌株悬液接种于马铃薯葡萄糖液体培养基，121°C灭菌、28°C发酵培养，得菌液； (3)抽滤菌液，分别收集菌丝体和发酵液；发酵液用萃取剂萃取，减压蒸馏、回收溶剂，得发酵液的提取物； (4)取发酵液的提取物，依次进行大孔树脂吸附柱层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶柱层析，最终纯化、洗脱，得终产物。
6.根据权利要求5所述的用蛇足石杉内生真菌制备吡咯类护肝化合物的方法，其特征在于，步骤(2)中发酵培养的条件为:温度28°C、180转/分钟的转速下振荡培养6天后静置培养14天。
7.根据权利要求6所述的用蛇足石杉内生真菌制备吡咯类护肝化合物的方法，其特征在于，步骤(3)中的萃取剂为乙酸乙酯。
8.—种如权利要求1~4所述的蛇足石杉内生真菌在制备吡咯类护肝药中的应用
【文档编号】C12R1/645GK103667073SQ201310445222
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】单伟光, 应优敏, 占扎君 申请人:浙江工业大学