一种人类环氧合酶-2的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于增加人环氧合酶-2的表达在转化细胞中，并检测优先和独立的DNA组成的人类环氧合酶-2的cDNA连接到3'侧翼序列的人类环氧合酶-1方法测量cyclogenase-2在样品。
【专利说明】一种人类环氧合酶-2
[0001]
【技术领域】
本发明涉及医药领域，尤其是一种人类环氧合酶-2。
_2] 发明背景
本发明包括一种人类环氧合酶-2蛋白包括人类高表达环氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳动物表达载体系统的高水平表达。
[0003]发挥非留体类抗炎药的抗炎，止痛和退热活性，并抑制激素诱导的子宫收缩和某些类型癌的生长，通过抑制前列腺素G / H合成酶，也被称为环氧合酶。直到最近，只有一种形式的环氧合酶其特征在于，这对应于环氧合酶-l(COX-l)，最初在牛的储精囊中确定的构成enyme。最近一种可诱导形式的环氧合酶(环氧合酶_2; C0X-2))的基因已被克隆，测序，其特征在于从鸡，小鼠和人源。cyclooxygnase-2是不同于这也被克隆,测序,其特征在于从绵羊，小鼠和人源的环氧合酶-1。环氧合酶-2的是快速和容易的代理，包括有丝分裂原，内毒素，激素，细胞因子和生长因子诱导的一些。由于前列腺素的生理和病理作用，我们得出的结论是本构酶，环氧合酶-1，负责大部分基底的内源性前列腺素释放，因此其生理功能是非常重要的，其中包括维护胃肠道的完整性和肾的血流量。与此相反，可诱导形式的酶，环氧合酶-2主要负责迅速诱导的酶会发生响应剂作为抗炎剂，激素，生长因子和细胞因子等的病理作用的前列腺素。因此，环氧合酶-2的选择性抑制剂将有类似的传统的非留体类抗炎药(NSAID)的抗炎，解热和镇痛性质，会抑制激素诱导的子宫收缩，将具有潜在的抗癌作用，但也将有能力都会下降，诱发一些机制为基础的副作用。特别是，这种选择性抑制剂应该有一个潜在的胃肠道毒性，肾的副作用降低的潜力，减少出血时间的影响，可能是阿司匹林敏感的哮喘患者的能力下降，诱发哮喘发作减少。
[0004]因此，本发明的一个目的是提供检测和材料，以识别和评估的药物是有效的抑制齐U，环氧合酶-2和环氧合酶-2的活性。
[0005]这也是本发明的一个目的是提供检测和材料，来识别和评估优先或选择性地抑制环氧合酶-2超过环氧合酶-1和环加氧酶-1活性和C0X-2活性的药物制剂。
【发明内容】
[0006]本发明包括一种人类环氧合酶-2蛋白包括人类高表达环氧合酶-2 (C0X-2)的cDNA和哺乳动物表达载体系统的高水平表达。
[0007]本发明还包括检测，以确定和评估的药物是有效的抑制剂，环氧合酶-2和环氧合酶-2的活性。本发明还包括检测，以确定和评估的药物制剂，优选地或选择性地抑制环氧合酶-2和环氧合酶-2超过环氧合酶-1和环氧化酶-1活性的活性。
[0008]本发明还包括重组DNA分子，其中的核苷酸序列编码人环氧合酶-2蛋白编码基因的3’侧翼序列连接到人的环氧合酶-l，C0X-2/C0X-l核苷酸序列的融合和系统的表达载体的人类环氧合酶-2蛋白的表达增强。
【具体实施方式】
[0009]在一个实施例中，本发明包括一个用于确定检测环氧合酶-2的活性的样品，包括以下步骤:(a)将(I)的人骨肉瘤细胞的制备，(2)的样品中，样品包括一个假定的环氧合酶-2的抑制剂，和(3)花生四烯酸，以及(b)确定在步骤(a)中产生的前列腺素的量E.sub.2。
[0010]为了本说明书的目的，人骨肉瘤细胞旨在包括，但不限于市售的人骨肉瘤细胞系，如那些可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国马里兰州罗克维尔，如骨肉瘤143B(ATTCCRL 8303 )和骨肉瘤143B PML BK TK (ATCC CRL 8304，我们发现骨肉瘤143.98.2，它最初是由威廉.萨格登博士，癌症研究麦克安德尔实验室，威斯康星大学麦迪逊分校，获得有用。现在我们已经在布达佩斯条约“与ATCC骨肉瘤143.98.2存款项下的鉴别骨肉瘤143.98.2(ATCC CRL 11226)于 1992 年 12 月 22 日。
[0011]为了本说明书的目的，应被定义为骨肉瘤细胞的制备人骨肉瘤细胞的单层或悬浮液的水溶液，其中的一部分会催化的合成的前列腺素E.sub.2 (PGE.sub.2)。此外，该制剂含有缓冲液如Hank氏平衡盐溶液。
[0012]于本实施例中是属人骨肉瘤细胞是从骨肉瘤的细胞类型，包括骨肉瘤143B和143B PML BK TK 143的家庭。我们已经使用了骨肉瘤143.98.2。
[0013]为了本说明书的目的还包括骨肉瘤细胞的制备人骨肉瘤微粒，其中的一部分会催化合成PGE.sub.2。的微粒可以通过以下方式获得，从这里所公开的任何骨肉瘤细胞系，如下所述。
[0014]第二实施例，本发明包括一种组合物，该组合物包括(a)的骨肉瘤细胞的制备，具有约103，约109骨肉瘤细胞，每毫升的细胞制备物，及(b) 0.1 50之间的。mu.1无过氧化物的花生四烯酸的每毫升的细胞准备。
[0015]通常情况下，细胞的制备将作为单层生长，使用的8.2.times.10.sup.42.times.10.sup.6每孔细胞的等分试样(约I毫升工作容积)中所描述的下面的协议。花生四烯酸是通常使用的量为I至20微升每孔约I毫升的工作容积。
[0016]骨肉瘤微粒时使用的，而不是全部的细胞，细胞制剂一般含有50至500微克每毫升的细胞制备的微粒体蛋白。花生四烯酸是通常使用的量为I至20。每毫升的细胞制备mu.1 酸。
[0017]第三实施例，本发明包括一个用于确定检测的环氧合酶-1活性的样品，包括以下步骤:(a)将(I)的细胞制备，表达环氧合酶-1的细胞，但不表达环氧合酶_2，(2)样品，样品包括一个假定环加氧酶-1抑制剂，(3)花生四烯酸，以及(b)确定在步骤(a)中产生的量PGE.sub.2。
【权利要求】
1.生产人类环氧合酶-2，包括:Ca)转染哺乳动物细胞的表达载体的编码人环氧合酶-2; (b)培养转染的细胞，及(c)从转染的细胞中回收人环氧合酶-2; 编码人环氧合酶-2的表达载体包括一个第一位置97至1909的序列的核苷酸序列，它包括其中；ID; NO:19或简并变体和第二个核苷酸序列，包含SEQ ; ID; NO:13，它的3’的第二个核苷酸序列的5’末端的第一个核苷酸序列所附带。
2.根据权利要求1所述的方法，其中哺乳动物细胞是选自下列组成的组:CV-1细胞，COS-1 细胞，COS-7 细胞，3T3 细胞，NIH/3T3 细胞，HeLa 细胞，C127I 细胞，BS-C-1 细胞，MRC-5细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中选自下列组成的组:牛痘病毒表达载体的哺乳动物的质粒表达载体，该表达载体。
【文档编号】C12N9/02GK104513815SQ201310448689
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月28日 优先权日:2013年9月28日
【发明者】陈晴川 申请人:上海满益科技有限公司