一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因。本发明提供了一种来源于腐质霉属Humicola?sp.P8的纤维素酶Cel61P8，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性纤维素酶的编码基因cel61P8。本发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH7.5，在pH4.0～11.0保持50%以上的酶活，最适温度65℃，在65℃具有良好的热稳定性。与纤维二糖水解酶协同作用，可以有效提高微晶纤维素的水解效率。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于纺织印染、能源工业等。
【专利说明】—种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]生物质的再生和降解是自然界中一个非常重要的环节，自然界中每年有15%的总碳通过植物被固定，其中50%的固定碳形成了结构多糖和木质素，通常将这一部分称为木质纤维素(Sandgren et al.Prog Biophys Mol Bio, 2005，89:246-291.)。植物通过光和作用每年可产生约400亿吨木质纤维素，木质纤维素主要由纤维素、木质素和半纤维组成，还含有少量的灰分、蛋白质和果胶(Dashtban et al.1nt J Biol Sci, 2009，5:578-595.)。纤维素的降解需要纤维素酶，纤维二糖水解酶，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中按纤维素酶催化反应的最适P H值，可将其分为酸性纤维素酶(最适PH值为3-5)、中性纤维素酶(最适pH值为6-8)和碱性纤维素酶(最适 PH 值为 8-11) (Zhang YHP, et al.Biotechnol Adv2006, 24:62-481.)。
[0003]纤维素酶在造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域均具有广泛的应用前景(WongKK, et al.Microbiol Revl988, 52:305-317.)。但是，不同的工业应用需求不同性质的纤维素酶，例如，饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要中性耐碱的纤维素酶。目前工业上广泛应用的木霉所产纤维素酶最适PH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，不能满足棉织品水洗整理工业的工业要求。由于棉纤维耐碱不耐酸，强酸性处理后易损坏(许爱国等，中性纤维素酶在棉织物整理中的应用，印染,2006，21，11-12)。
[0004]目前，国内纺织工业主要依赖进口，且价格昂贵。因此，获得新型具有耐碱高温的中性纤维素酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有中性、热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于纺织、能源等领域。本发明中来源于腐质霉属Humicola sp.P8的纤维素酶Cel61P8具有以下性质:最适pH7.5，并在pH5.0~9.0范围内具有40%以上的酶活力，具有很好的PH稳定性，37°C下作用2h后，在pH4.0-11.0之间，剩余酶活性均在50%以上。最适温度65°C，80°C都有较好的稳定性，保温60min后仍保持60%以上的酶活。中性和碱性范围内具有较高酶活力，良好的PH和热稳定性等特性，并且与纤维二糖水解酶协同作用，在复合纤维素酶中添加可以有效提高微晶纤维素的水解效率，使其在纺织、能源工业应用上具有很大的潜力。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温中性纤维素酶。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述耐高温中性纤维素酶的基因。
[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温中性纤维素酶的基因工程方法。[0010]本发明的另一目的提供上述耐高温中性纤维素酶的应用。
[0011]本发明从腐质霉(Humicola sp.P8)中分离得到一种新的耐高温中性纤维素酶Cel61P8。
[0012]本发明提供了一种纤维素酶Cel61P8，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
【权利要求】
1.一种耐高温中性纤维素酶Cel61P8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2 所示。
2.一种耐高温中性纤维素酶基因cel61P8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温中性纤维素酶Cel61P8。
3.如权利要求2所述的耐高温中性纤维素酶基因cel61P8，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC-Cel61P8。
6.包含权利要求2所述耐高温中性纤维素酶基因cel61P8的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.一种制备权利要求1所述耐高温中性纤维素酶cel61P8的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达； 3)回收并纯化所表达的纤维素酶Cel61P8。
9.权利要求1所述耐高·温中性纤维素酶Cel61P8的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103525791SQ201310480001
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】王兴吉, 郭庆文, 王忠连, 李芳芳, 刘文龙, 孙硕, 钱娟娟 申请人:山东隆科特酶制剂有限公司