一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法及制备的马奶醋的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法及制备的马奶醋。通过以新疆乌鲁木齐南山地区新鲜马奶为原料，在单因素试验的基础上，利用自筛选干酪乳杆菌(Lactobacillus?casei)WWMR-1?CGMCC?No.8244基础上，联合马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces?marxianus)和醋酸菌(Acetic?acid?bacteria)按照体积比计3：5：10组成复合菌种混合发酵，采用响应面法优化确定马奶醋的酒精发酵和醋酸发酵条件的最佳制备工艺参数，确定提供一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法及制备的马奶醋，为充分开发利用新疆马奶资源具有重要的现实开发价值。
【专利说明】一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法及制备的马奶醋
发明领域
[0001]本发明涉及微生物发酵【技术领域】，具体的，本发明涉及一种采用微生物菌种混合发酵制备马奶醋的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]马奶是新疆少数民族饮食文化中的瑰宝。马奶的营养价值很高，与其他畜类奶相比含有丰富的蛋白质、乳糖、维生素和矿物质，并含有人体不可缺少的氨基酸和脂肪酸。马奶中富含多种营养物质，易被人体吸收利用，特别适合婴幼儿和老弱病人饮用，且具有补虚强身、润燥美肤、清热止渴的作用。草原鲜马奶杂质少，用其酿出的马奶酒所含甲醇、异丁醇、异戊醇成份极低，铅、汞等重金属不足于国家标准的十分之一，甲醛的含量更是少之又少。
[0003]目前，国内市面上出现以马奶为原料的食品有酸马奶、马奶粉、马奶酒、马奶啤酒等，但关于马奶醋产品鲜有报道。马奶醋作为一种新型的马奶饮品，不仅保留了马奶中丰富的营养，更赋予其醋的保健功能，是非常有潜质的开发项目，且具有极大的市场推广空间。研究开发具有实用性的微生物菌种获得稳定的马奶醋发酵制备工艺具有重要作用。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中未见有关利用复合菌种混合发酵制备马奶醋开发利用的现状，基于新疆地区各民族长期饮用马奶的地缘优势，充分利用新疆马奶发酵不同产地的微生物群落资源，开发适用于马奶醋的复合微生物菌种制剂。本发明目的在于提供一种采用复合菌种混合发酵制备马奶醋及其制备的方法。
[0005]本发明的技术方案:
[0006]通过以新疆乌鲁木齐南山地区新鲜马奶为原料，在单因素试验的基础上，利用自筛选干酪乳杆菌基础上，联合马克思克鲁维酵母菌和醋酸菌组成复合菌种混合发酵，采用响应面法优化确定马奶醋的酒精发酵和醋酸发酵条件的最佳制备工艺参数，确定提供一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法及制备的马奶醋，为充分开发利用新疆马奶资源具有重要的现实开发价值。
[0007]具体的，本发明提供了一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的复合菌种，复合菌种由干酿乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR_l、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus}和醋酸菌(Acetic acid bacteria)按照体积比计 3:5: 10 组成。
[0008]本发明选用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR_l,根据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆玛纳斯县牧民家采集的自制酸驼乳中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从酸驼乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，从中优选出一株编号为WWMR-1的菌株，菌种经培养后菌落呈边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5—3mm的菌落，进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌；该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和&5、不运动，不能够发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能够在15°C生长，具有接种后生长稳定，延迟期短，适应快，发酵初期产酸能力较强。经微生物学分类与鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
[0009]本发明具体米用的菌种编号为WWMR-1的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),该细菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定乳酸菌菌株；该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5-3_的菌落；进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌；该菌株培养条件:培养温度37°C，最适培养温度37°C ;优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基组分牛肉膏10.0g / L，酵母膏5.0g / L，葡萄糖20.0g / L，乙酸钠5.0g /L，柠檬酸氢二胺2.0g / L，吐温-801.0ml / L，磷酸氢二钾2.0g / L，七水硫酸镁0.2g /L，七水硫酸锰0.05g / L，蒸馏水1.0L,固体培养基加琼脂20.0g / L ;菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5 — 3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革兰氏阳性菌。
[0010]结合上述该菌种的菌落形态、生理生化特性，初步确定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey, s Manual ofSystematic Bacterio一 logy)))第九版和《常用细菌系统鉴定于册》等对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) (CGMCC N0.8244)菌株进行形态学测定、生理生化检测，结合该菌种的16S rDNA同源分析、系统发育分析结果，确定菌种编号为WWMR — I菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,该菌种于申请日前已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，保藏日期是2013年09月23日，保藏号是CGMCC N0.8244。经上述微生物学综合鉴定归属为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)。
[0011]同时，本发明提供了菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCCN0.8244的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，37°C，135r / min培养18 — 24h。
[0012]本发明选用外购菌种:马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus),该菌株具有在发酵过程中耐酸性强，产酒精能力将强，环境适应性强，变异性小的属性。采用该菌种的培养条件培养温度28°C，最适培养温度28°C ;优先生长于YPD培养基表面，YPD培养基组分采用酵母膏IOg / L，蛋白胨20g / L，葡萄糖20g / L，固体培养基加入20g / L琼脂粉。同时，本发明提供菌株马克思克鲁维酵母茵(Kluyveromyces marxianus)的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，30 0C，135r / min培养48h。
[0013]本发明外购一株醋酸菌(Acetic acid bacteria),该菌株具有产酸能力高,发酵周期短的特点。该菌株培养条件:培养温度30°C，最适培养温度30°C ;优先生长于ASl.41培养基，培养基表面，ASl.41培养基组分葡萄糖IOg / L、酵母膏IOg / L、碳酸钙15g / L、琼脂20g / L、无水乙醇20ml / L。同时,本发明提供醋酸菌(Acetic acidbacteria)的发酵工艺:在无菌条件下，挑取该菌株，300C，135r / min培养48h。
[0014]同时，本发明提供一种采用如上提供的复合菌种混合发酵制备马醋的方法，具体制备方法步骤如下:
[0015](I)种子发酵液及母发酵液的制备:种子发酵液:将4°C下保存的菌种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC N0.8244、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)和醋酸菌(Acetic acid bacteria)在无菌环境下分别接种于MRS培养基、YPD培养基和ASl.41培养基中活化，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，以备后期使用；母发酵液:将预处理好的马奶分装于发酵容器中，在无菌条件下，将已活化好的乳酸菌、酵母菌和醋酸菌种子发酵液按5%接种量接入发酵容器中，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，以备后期使用。
[0016](2)马奶预处理:将新鲜马奶用四层纱布过滤除去马奶中的杂质和异物，再将马奶预热到65°C，在20MPa条件下均质5min ;均质后将马奶进行巴氏杀菌，放置冷却至室温，待发酵用。 [0017](3)酒精发酵:将步骤(1)制备的乳酸菌与酵母菌发酵液按照体积比3:5计混合后加入步骤(2)制备的马奶中，加入葡萄糖，加糖量按照8g / 100ml添加，在32°C，135r /min，培养80h，得到酒精度为7% (V / V)的马奶酒精发酵液。
[0018](4)醋酸发酵:按照体积比计，将步骤(1)制备的醋酸菌(Acetic acid bacteria)按10%的接种量于步骤(3)制备的酒精发酵液中，要求酒精起始酒精度为8% (V / V)，最优发酵温度为33°C，135r / min，培养5天，得到酸度为120° T的马奶醋酸发酵液。
[0019](5)后处理:待产品至发酵终点后，酸度在120° T，进行巴氏杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得马醋。
[0020]本发明中，酒精度测定采用蒸馏得到酒精水溶液后用酒精计测定；酸度测定采用酸碱滴定法测定；糖度测定使用手持糖度计测定；感官评价、理化指标测定参考GB /T15038-2006。
[0021]本发明通过上述技术方案制备的马醋的产品质量特征:
[0022](I)感官指标:色泽:乳白色，微黄具有马奶固有的色泽；香气:马奶味香郁，醋酸味醇厚具有马奶醋特有的香气；滋味:酸味爽口、无异味；体态:乳浊液容许少许沉淀。
[0023](2)理化指标:总酸:120° T，还原糖含量≤4g / L，V。含量为68.72mg / 100mL。
[0024](3)微生物指标:菌落总数(cfu / mL) ( 100 ;大肠菌群(MPN / IOOmL) ( 3 ;致病菌:未检出。
[0025]通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下技术效果:
[0026]1.本发明提供的发酵制备马醋的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC N0.8244，该菌株能在低pH值时活性较强，热稳定性好，抗菌谱广，产生细菌素；在发酵过程中产生主要是乳酸等有机酸，使PH值降低来抑制一些腐败菌和致病菌的生长，并改善食品的品质和风味。
[0027]2.采用本发明设定的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC N0.8244、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)和醋酸菌(Acetic acid bacteria)组成复合菌种混合发酵制备马醋，乳酸菌和酵母菌混合发酵不仅促进各自菌数的增长，而且可调控代谢产物的变化，在提高特殊风味和香气方面起着重要的作用，制备的马奶醋作为一种新型的马奶饮品，微黄具有马奶固有的色泽和香气，醋酸味醇厚；不仅保留了马奶中丰富的营养，更赋予其醋的保健功能。
【专利附图】
【附图说明】[0028]图1显示为采用复合菌种混合发酵制备马醋的工艺流程图。
[0029]图2显示为干酪乳杆菌保藏菌株的菌落形态图。
[0030]图3显示为干酪乳杆菌保藏菌株的系统进化发育树图。
[0031]图4显示为接种量与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的响应面图。
[0032]图5显示为接种量与发酵温度相互作用对酒精发酵影响的响应面图。
[0033]图6显示为发酵温度与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的响应面图。
[0034]图7显示为不同接菌量对酸度的影响。
[0035]图8显示为不同起始酒精度对酸度的影响。
[0036]图9显示为不同发酵温度对酸度的影响。
[0037]图10显示为不同发酵时间对酸度的影响。
[0038]图11显示为酒精度和接种量交互影响酸度的响应面图。
[0039]图12显示为发酵温度和酒精度交互影响酸度的响应面图。
[0040]图13显示为发酵温度和接种量交互影响酸度的响应面图。
【具体实施方式】
[0041]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0042]采用的主要的仪器设备:LD2X_50KB立式电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器厂)；HR40-1IA2生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；DHP-781电热恒温培养箱(河北省黄石市医疗器械厂)；DZKW-172电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)；CH2176J微电脑电磁炉(中山市格兰仕生活电器制造有限公司)；SXKW数显控温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)。
[0043]本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0044]实施例一:干酿乳杆菌(Lactobacilluscasei)WWMR-1CGMCC N0.8244 的筛选、分离纯化和鉴定
[0045]初筛:取传统发酵酸驼乳ImL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上充分混合均匀。将发酵酸驼乳以10倍级进行稀释，稀释度为ιο'ιο'ιο'ιο'ιο—5、10_6。用移液器吸取上述稀释度样液各lmL，采用倾注法倒入改良MRS培养基，平板置于37°C培养箱中培养24h。观察并记录菌落特征并挑取有透明圈的不同形态单个菌落，进行革兰氏染色，挑取革兰氏染色阳性菌落，在显微镜油镜下观察细胞形态，并对疑似的菌种进行编号。
[0046]菌种的纯化:将疑似产透明圈的菌株再接利于MRS琼脂培养基，于37°C培养箱恒温培养24h，重复3~4次纯化乳酸菌。纯化后的乳酸菌菌株接种于改良MRS斜面，37°C培养箱恒温培养24h后，4°C保存备用。
[0047]本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从酸驼乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，菌种保藏编号为 CGMCC N0.8244。
[0048]本发明具体提供了一种干酪乳杆菌，命名为WWMR-1，编号为CGMCC N0.8244，其能够产乳酸。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey, s Manual of SystematicBacterio-1ogy)))第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对干酪乳杆菌(菌种的编号CGMCCN0.8244)菌株进行形态学测定，生理生化检测,确定干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(编号CGMCC N0.8244)菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，保藏日期是2013年09月23日，保藏号是CGMCC N0.8244。
[0049]该菌株培养条件:培养温度37°C，最适培养温度37°C ;优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基组分牛肉膏10.0g / L，酵母膏5.0g / L，葡萄糖20.0g / L，乙酸钠5.0g /L，柠檬酸氢二胺2.0g / L，吐温-801.0ml / L，磷酸氢二钾2.0g / L，七水硫酸镁0.2g /L，七水硫酸锰0.05g / L，蒸馏水1L，固体培养基加琼脂20.0g / L。菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧而凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革兰氏阳性菌。
[0050]菌株的鉴定:
[0051](I)生理生化鉴定:该细菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定乳酸菌菌株；该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5-3mm的菌落。进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌。该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和&5、不运动，不能够发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能够在15°C生长，经16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为WWMR — I的菌株经生理生化鉴定鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。参见附图 2。
[0052](2) 16S rDNA序列比对及系统发育分析:将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rDNA序列，用MEGA5.0中Maximum Likelihood法构建系统进化树。菌株WWMR-1的16S rDNA序列与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的相似性最高为 99%,
[0053]将该菌株的16S rDNA序列与GenBank中下载的近缘属序列进行系统发育分析,米用MEGA5.0软件构建系统发育树，结果参见附图3所示，菌种编号为WWMR-1的菌株隶属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),与Lactobacillus casei亲源关系最近，同源相似性为99%，确定菌株WWMR — I为干酪乳杆菌，结合上述提供的菌种编号为WWMR-1的菌落形态、生理生化特性，生物学分类名称为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
[0054]菌株WWMR-1的16S rDNA序列如下，具体序列参见附后的序列表:
[0055]
【权利要求】
1.一种适用于马奶醋发酵的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR_l,其特征在于，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1的菌种保藏编号为CGMCC N0.8244。
2.一种复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法，其特征在于，具体制备方法步骤如下: (1)种子发酵液及母发酵液的制备:种子发酵液:将4°C下保存的菌种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) WWMR-1CGMCC N0.8244、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)和醋酸菌(Acetic acid bacteria)在无菌环境下分别接种于MRS培养基、YPD培养基和ASl.41培养基中活化，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，以备后期使用；母发酵液:将预处理好的马奶分装于发酵容器中，在无菌条件下，将已活化好的乳酸菌、酵母菌和醋酸菌种子发酵液按5%接种量接入发酵容器中，分别置于37°C培养24h、28°C培养48h和30°C培养48h，以备后期使用； (2)马奶预处理:将新鲜马奶用四层纱布过滤除去马奶中的杂质和异物，再将马奶预热到65°C，在20MPa条件下均质5min ;均质后将马奶进行巴氏杀菌，放置冷却至室温，待发酵用； (3)酒精发酵:将步骤(1)制备的乳酸菌与酵母菌发酵液按照体积比3:5计混合后加入步骤(2)制备的马奶中，加入葡萄糖，加糖量按照8g / 100ml添加，在32°C，135r / min,培养80h，得到酒精度为7% (V / V)的马奶酒精发酵液； (4)醋酸发酵:按照体积比计，将步骤(1)制备的醋酸菌(Aceticacid bacteria)按10%的接种量于步骤(3)制备的酒精发酵液中，要求酒精起始酒精度为8% (V / V)，最优发酵温度为33°C，135r / min，培养5天，得到酸度为120° T的马奶醋酸发酵液； (5)后处理:待产品至发酵终点后，酸度在120°T，进行巴氏杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得马醋。
3.如权利要求2所述的复合菌种混合发酵制备马奶醋的方法，其特征在于，所述的MRS培养基、YPD培养基和ASl.41培养基分别为: (1)MRS培养基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温_801mL，蒸馏水1000mL ； (2)YPD培养基:酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL ； (3)ASl.41培养基:葡萄糖10g、酵母膏10g、碳酸钙15g、琼脂20g、无水乙醇20ml,蒸懼水 1000mL。
4.一种如权利要求2所述复合菌种混合发酵方法制备的马奶醋。
【文档编号】C12J1/04GK103540553SQ201310529793
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】武运, 王璐, 杨海燕, 刘武军, 王小标, 古丽娜孜, 王伟, 张珍珍, 艾乃吐拉, 艾克拜尔 申请人:新疆农业大学