一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，属于生物【技术领域】。具体构建方法及过程如下：(1)提取和纯化总RNA；(2)合成cDNA第一链；(3)合成cDNA第二链；(4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接；(5)体外包装；(6)cDNA文库的鉴定、扩增。本发明通过建立多浪羊的cDNA文库，有利于进一步研究新疆多浪羊的免疫分子并为保存物种信息奠定坚实的基础。对于现阶段利用分子克隆技术而言，建立多浪羊的cDNA文库，用相应的探针进行标记，筛选出目的基因和与目的基因相关的基因，也是目前获取新基因的重要手段。
【专利说明】—种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]新疆多浪羊又称“麦盖提羊”，是新疆地方良种肉用羊品种之一，该羊具有体格大，肉脂兼用型明显，体质结实，遗传性稳定，早熟，抗寒，抗病，耐粗饲，肉质鲜美，无膻味等。鉴于多浪羊有以上的优良特性，所以为了加快资源优势向经济优势转变，如何提高多浪羊的品质和养殖效率，扩大养殖范围，是新疆畜牧业未来的一个重要的发展方向。
[0003]淋巴细胞是机体免疫系统的组成部分，是机体的免疫活性细胞，可分泌多种重要的细胞因子，其中表达的基因不仅与免疫功能有关，而且与细胞信号转导、生长发育、血细胞、神经细胞再生等有密切的关系。因此，研究淋巴细胞基因的表达对人及动物的免疫机制的研究有很大的帮助，是一个重要的研究领域。
[0004]cDNA文库是富集了特异组织细胞所有表达基因mRNA的反转录cDNA序列信息库，是研究基因功能的重要工具，随着分子生物技术的发展，cDNA文库技术方法经历了一个逐步发展完善的过程，满足了广大研究者对筛选基因的需要。
[0005]通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍稀生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针。更重要的是可以用于分离全长基因进而展开基因功能研究。cDNA文库的构建是文库应用的基础，构建一个高质量的cDNA文库，决定了文库的使用价值，并为进行深入研究奠定了基础。因此，构建多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库具有广泛的应用价值，通过对多浪羊cDNA文库的高通量筛选，获得多浪羊免疫相关基因，为探讨多浪羊的免疫机制、获得抗病力强的个体提供重要的依据。
【发明内容】
[0006]本发明的目的提供一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，以便建立多浪羊的cDNA文库，有利于进一步开展相关免疫学研究并为保存物种信息奠定了坚实的基础。
[0007]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0008]一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，具体构建方法及过程如下:
[0009](I)提取和纯化总RNA:采集新疆多浪羊颈静脉血20mL加2mL枸橼酸钠，分离淋巴细胞，利用Trizol法提取总RNA，纯化后置于_70°C保存备用。
[0010](2)合成 cDNA 第一链:以 3yL 总 RNA(1.0y g)为模板，加入 IyL SMART IVoligonucleotide、I μ L CDS III / 3, PCR Primer,混匀，瞬时离心后 72°C孵育 2min,冰浴2min，瞬时离心后，依次加入 2yL5XFirst-stand BufferU μ L DTTU.0μ L dNTP Mix、1.0 μ L Power Script Reverse Transcriptase 混匀，瞬时离心后 42°C孵育 lh,将试管放在冰上，终止第一链的合成。
[0011](3)合成cDNA第二链:将PCR仪热循环前进行95°C预加热。在反应管中加入2μ LFirst-Stand cDNA、80 μ L ddH20、10 μ LlOX Advantage2PCR Buffer、2 μ L50XdNTP Mix、2uL5，PCR primer、2uL CDSIII / 3，PCR Primer、2 μ L50XAdvantage2Polymerase Mix混匀，瞬时离心放入PCR仪内。PCR反应条件:95°C lmin，95°C 15s，68°C 6min，22个循环，72°C延伸5min，反应产物用5 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0012](4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接:双链cDNA合成后经蛋白酶K消化，SfiI酶切后用CHROMA SPIN-400柱分离除去小于500bp的cDNA，从收集的16个组分中各取5 μ L，经150V，IOmin琼脂糖凝胶电泳，将含有所需片段的cDNA组分合并，用I / 10体积的乙酸钠(3M),L3yL Glyecogen (20mg / mL), 2.5倍体积95 %的乙醇沉淀过夜后与λ TriplEx2Vector 载体 16°C连接 24h。
[0013](5)体外包装:采用Gigapack III Gold packaging Extract对连接物进行包装。从_80°C的冰箱中取出包装蛋白，放在手指间溶解，取3μ L连接后的cDNA加入到包装蛋白中央，轻轻混匀，避免产生气泡，然后快速离心3-5s，22°C水浴2h。孵育好后加500 μ L SMbuffer, 20 μ L的氯仿,轻轻混匀，瞬时离心除去细胞碎片,4?Ι&存。即为cDNA初始文库。
[0014](6) cDNA文库的鉴定、扩增，包括以下步骤:
[0015]第一步，cDNA初始文库滴度及重组率测定:将得到的cDNA文库按10'10_2、10'IO-4稀释，各取1 μ L与200 μ L宿主菌XL1-Blue (OD600=0.5)孵育15min后，铺平板，计算初始文库滴度。
[0016]第二步:鉴定cDNA文库插入片段的大小:平板上随机挑取144个噬菌斑，以5’ LDprimer和3’LD primer为引物进行PCR扩增，其产物经电泳后鉴定插入cDNA片段的大小。
[0017]第三步:文库的扩增:用5 X IO4个噬菌体与600 μ L宿主菌XL1-Blue (OD6qq=0.5)孵育孵育15min后，铺6个平板，42°C孵育6h。然后每板加入9mL的SM buffer4°C摇动洗16h后回收噬菌体和细菌悬浮液，加入氯仿至终浓度的5% (V / V)，混合均匀后于室温15min，2600g / min，离心IOmin后，上清用7% DMSO (V / V)混合均匀后分装置于_70°C保存。
[0018]第四步:cDNA扩增文库滴度测定将扩增后的cDNA文库按10'10_2、10'10_4稀释，各取I μ L加200 μ L宿主菌XL1-Blue (OD600=0.5)孵育15min后，，铺平板，计算扩增后的cDNA文库滴度。
[0019]该发明的有益效果在于:本发明通过建立多浪羊的淋巴细胞cDNA文库，有利于进一步进行新疆多浪羊相关免疫学研究并为保存物种信息奠定了坚实的基础。对于现阶段利用分子克隆技术而言，建立多浪羊的cDNA文库，然后用相应的探针进行标记，筛选出目的基因和与目的基因相关的基因，也是是目前获取新基因的重要手段。cDNA分子不含内含子序列和调控序列，且与蛋白质的氨基酸序列具有对应性，因此，构建cDNA文库是筛选新基因、分离已知基因、揭示某些因素对基因表达的影响的基础，尤其是目前正蓬勃发展起来的基因芯片技术更离不开cDNA文库这一基础平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例中多浪羊外周血淋巴细胞分离图谱(1:分离前；2:分离后)。
[0021]图2为本发明实施例中多浪羊淋巴细胞总RNA基因电泳图谱(M:DNA分子量标准，DL2000 ;泳道 1,2:RNA 基因)。
[0022]图3为本发明实施例中多浪羊淋巴细胞dsDNA电泳图谱(Ml =DNA分子量标准，IKb ；M2:DNA 分子量标准，DL2000 ;泳道 1:dsDNA)。
[0023]图4为本发明实施例中初始文库稀释10_2培养噬菌斑的图。
[0024]图5为本发明实施例中随机挑取克隆的插入片段PCR结果图(M =DNA分子量标，DL2000)。
[0025]图6为本发明实施例中扩增文库稀释10_5培养噬菌斑图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图和实施例进一步阐述该发明的【具体实施方式】。
[0027]实施例
[0028]本实施例中，新疆多浪羊由塔里木大学动物科学学院试验站提供；宿主菌E.coliXL1-WueJ.coli BM25.8由Clontech提供，保存于新疆塔里木大学动物科学学院实验室。
[0029]本实施例中，总RNA 提取试剂 Trizol (Invitrogen)、SMARTIV cDNA libraryconstruction kit 文库构建试剂盒(Clontech)、λ TriplEx2Vector 载体(Clontech)、Gigapack III Gold packaging Extract(STRATAGENE)0
[0030]该实施例中，新疆`多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法及结果具体如下:
[0031](I)提取和纯化总RNA:采集新疆多浪羊颈静脉血20mL加2mL枸橼酸钠，对多浪羊外周血淋巴细胞进行分离，最后将其外周血混合液分出四层，从上至下依次为血浆层，淋巴细胞层，分尚液层，红细胞层，结果见图1。
[0032]利用Trizol法提取总RNA，纯化后置于_70°C保存备用。利用Trizol法从新疆多浪羊淋巴细胞中提取的较为完整的总RNA，在真核细胞RNA中的28s、18s及5s RNA条带浓度较高，经RNA电泳后可见28s和18sRNA的强度比约为2: 1，降解较少，说明提取了较好的总RNA，见图2。
[0033](2)合成 cDNA 第一链:以 3yg mRNA 为模板，加入 IyL SMART IVoligonucleotide、I μ L CDSIII / 3, PCR Primer,混匀，瞬时离心后 72 °C 2min,立即冰浴2min,离心将管中物质都富集到管底后依次加入2 μ L5XFirst-stand Buffer> 1.0yLDTT> 1.0 μ L dNTP Mix> 1.0 μ L Power Script Reverse Transcriptase 混匀，瞬时离心后42°C lh,将试管放在冰上,终止第一链的合成。
[0034](3)合成cDNA第二链:将PCR仪热循环前进行95°C预加热。在反应管中加入2μ LFirst-Stand cDNA>80 μ L ddH20>10 μ LlOXAdvantage2PCR Buffer>2 μ L50X dNTP Mix、2uL5’PCR primer>2 μ L CDSIII / 3’ PCR Primer >2 μ L50 X Advantage2Polymerase Mix混匀，瞬时离心放入PCR仪内。PCR反应条件:95°C lmin，95°C 15s，68°C 6min，22个循环，72°C延伸5min。反应产物用5 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测。可见dsDNA形成弥散条带在0.l_4kb之间，见图3。
[0035](4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接:双链cDNA合成后经蛋白酶K消化，Sfi I酶切后用CHROMA SPIN-400柱分离除去小于500bp的cDNA，从收集的16个组分中各取5 μ L，经150V，IOmin琼脂糖凝胶电泳，将含有所需片段的cDNA组分合并，用I / 10体积的NaAc (3M), 1.3 μ LGlyecogen (20mg / mL), 2.5倍体积95 %的乙醇沉淀过夜后与λ TriplEx2Vector 载体 16°C连接 24h。
[0036](5)体外包装:采用Gigapack III Gold packaging Extract对连接物进行包装。从-80。C的冰箱中取出包装蛋白，用手溶解，取3μ L连接后的cDNA加入到包装蛋白中央，轻轻混匀，避免产生气泡，然后快速离心3-5s，22°C水浴2h。孵育好后加500 μ LSM buffer,20 μ L的氯仿，轻轻混匀，瞬时离心除去细胞碎片，4°C贮存。即为cDNA初始文库。
[0037](6) cDNA文库的鉴定、扩增，包括以下步骤:
[0038]第一步，cDNA初始文库滴度及重组率测定:将得到的cDNA文库按10'10'10'10_4稀释，各取I μ L加9 μ L SMbuffer感染对数期生长的XL1-Blue,铺平板，计算初始文库滴度。在Top中加入0.01% (w / v)X-gal和2mmol / I IPTG，铺板培养，根据蓝白斑数计
算重组率。
[0039]取初始文库1μ I稀释为10'10_2、10_3、10_4涂板，37°C过夜培养后取出平皿，计数噬菌斑的数量，10_2为502个、10_3为67个、10_4为7个，利用10_2计算出初始文库的滴度为5.6 X IO6个/ mL,初始文库稀释10-2所培养的曬菌斑如图4所不。
[0040]第二步:鉴定插入cDNA片段的大小:平板上随机挑取144个噬菌斑，以5’ LDprimer和3’ LD primer为引物进行PCR反应，其产物经电泳后鉴定出插入cDNA片段的大小。经统计，有22.1 %的插入片段大于1000bp，46.8%的插入片段在750-1000bp之间，20.2%的的插入片段在500-750bp，5.4%的插入片段小于500bp，可见有89.1 %的插入片段大于500bp，保证了 文库的完整性。PCR扩增的cDNA片段大小分布结果其中一幅如图5所示。
[0041]第三步:文库的扩增:用5 X IO4个噬菌体感染宿主菌XL1-Blue,铺6个平板，42°C孵育6h。然后每板加入9mL的SM buffer4°C摇动洗16h后收获，加入氯仿沉淀蛋白，最后用终体积的7%的DMSO悬浮上清液，分装后置_70°C保存。
[0042]第四步:cDNA扩增文库滴度测定将扩增后的cDNA文库倍比稀释，取10μ L稀释液感染对数期生长的XL1-Blue,铺平板，计算扩增后的cDNA文库滴度。
[0043]按5X104将初始文库扩增后取I μ L进行滴度测定，将其稀释到10_7，计数噬菌斑的数量，10_5为156个、10_6为14个、10_7为I个，利用10_5计算出扩增文库的滴度为1.5 X 101°个/ mL，扩增文库稀释10_4所培养的噬菌斑如图6所示。
[0044]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种新疆多浪羊外周血淋巴细胞cDNA文库的构建方法，其特征在于：具体构建方法 及过程如下：(1)提取和纯化总RNA:采集新疆多浪羊颈静脉血20mL加2mL枸橼酸钠，分离淋巴细 胞，利用Trizol法提取总RNA，纯化后置于_70°C保存备用；(2)合成cDNA 第一链：以 3 ii L 总 RNA(1. 0 u g)为模板，加入 1 y L SMARTIV oligonucleotide、1 u L CDSIII / 3, PCR Primer,混勻，瞬时离心后 72°C孵育 2min,冰浴 2min，瞬时离心后，依次加入 L5XFirst-stand Buffer,1 U L DTTU. Ou L dNTP Mix、 1. 0 u L Power Script Reverse Transcriptase 混勻，瞬时离心后 42°C孵育 lh,将试管放在 冰上，终止第一链的合成；(3)合成cDNA第二链：将PCR仪热循环前进行95°C预加热；在反应管中加入2yL First-Stand cDNA、80 u L ddH20、10 u L10 X Advantage2PCR Buffer、2 u L50XdNTP Mix、 2uL5，PCR primer、2uL CDS III / 3，PCR Primer^2 u L50XAdvantage2Polymerase Mix 混匀，瞬时离心放入PCR仪内；PCR反应条件：95°C lmin，95°C 15s，68°C 6min，22个循环， 72°C延伸5min，反应产物用5 u L进行琼脂糖凝胶电泳检测；(4)对产物进行消化、酶切、过柱分离及连接：双链cDNA合成后经蛋白酶K消化，Sfil 酶切后用CHROMA SPIN-400柱分离除去小于500bp的cDNA，从收集的16个组分中各取 5iiL，经150V，10min琼脂糖凝胶电泳，将含有所需片段的cDNA组分合并，用1 / 10体 积的乙酸钠（3M),1.3iiL Glyecogen(20mg / mL), 2. 5倍体积95 %的乙醇沉淀过夜后与 入 TriplEx2Vector 载体 16°C连接 24h ；(5)体外包装：采用GigapackIII Gold packaging Extract对连接物进行包装； 从_80°C的冰箱中取出包装蛋白，放在手指间溶解，取3 y L连接后的cDNA加入到包装蛋白 中央，轻轻混匀，避免产生气泡，然后快速离心3-5s，22°C水浴2h ;孵育好后加500 y L SM buffer, 20 ii L的氯仿，轻轻混勻，瞬时离心除去细胞碎片,4°C|C存，即为cDNA初始文库；(6)cDNA文库的鉴定、扩增，包括以下步骤：第一步，cDNA初始文库滴度及重组率测定：将得到的cDNA文库按10—1、10_2、10_3、10_4稀 释，各取liiL与200iiL宿主菌XLi-BludOD^zO. 5)孵育15min后，铺平板，计算初始文库 滴度；第二步：鉴定cDNA文库插入片段的大小：平板上随机挑取144个噬菌斑，以5’ LD primer和3’LD primer为引物进行PCR扩增，其产物经电泳后鉴定插入cDNA片段的大小；第三步：文库的扩增：用5X104个噬菌体与600ii L宿主菌XLi-BlueO^^O. 5)孵育孵 育15min后铺平板，42°C孵育6h ;然后每板加入9mL的SM buffer4°C摇动洗16h后回收噬 菌体和细菌悬浮液，加入氯仿至终浓度的5% (V / V)，混合均匀后于室温15min，2600g / min，离心lOmin后，上清用7% DMS0(V / V)混合均匀后分装置于_70°C保存；第四步：cDNA扩增文库滴度测定将扩增后的cDNA文库按10—1、10_2、10_3、10_4稀释，各取 1 ii L加200 ii L宿主菌XL「Blue (0D600=0 . 5)孵育15min后，铺平板，计算扩增后的cDNA文 库滴度。
【文档编号】C12N15/70GK103820864SQ201310537998
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】李莲瑞, 潘伊微, 贾山岭, 王娟娟, 曾国航, 徐宏伟, 李玮 申请人:塔里木大学