一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法
【专利摘要】本发明涉及一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法。将融合了生物素受体肽序列的衣壳蛋白序列和催化受体肽生物素化的酶序列同时插入到病毒全基因组，得到重组病毒质粒，借助病毒质粒在宿主细胞内的复制过程实现核衣壳的生物素化，继而采用偶联有链霉亲和素的量子点实现对包膜病毒核衣壳的标记。本发明无需通过剧烈的化学反应改造和标记病毒，有利于保持病毒本身的侵染活性，且包膜病毒内部核衣壳的标记不影响包膜病毒表面及其对细胞的识别。本发明可应用于病毒侵染机理研究及与病毒相关的疾病治疗研究。
【专利说明】一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于化学和生物医学领域，涉及一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法。【背景技术】
[0003]病毒侵染细胞机制研究对预防和治疗病毒引起的疾病至关重要，对活病毒的荧光标记可以为研究病毒侵染机制提供重要基础。传统的荧光标记物往往存在易光漂等缺点，而半导体荧光量子点具有独特的光学性能，如荧光量子产率高、激发光谱宽、发射光谱窄等，因此近年来出现了许多采用量子点标记病毒的方法。包膜病毒广泛存在于自然界并且与人类健康密切相关，因此在相关研究中受到极大关注。然而，目前还只能实现量子点对包膜病毒表面包膜的标记，可能干扰病毒对细胞受体的识别及影响病毒的侵染活性，因此采用量子点标记包膜病毒内部的核衣壳是一种更优选择。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足提供一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法。
[0005]本发明利用包膜病毒基因组允许外源基因插入和在宿主细胞内自我复制的特点，构建了重组病毒基因组质粒。将这种质粒转染其宿主细胞，核衣壳能够在病毒组装过程中被生物素化并出芽带上包膜，从而获得带有生物素化核衣壳的重组包膜病毒。利用生物素和链霉亲和素的相互作用，用偶联有链酶亲和素的量子点标记重组病毒，实现量子点对活包膜病毒核衣壳的标记(如图1所示)。
[0006]本发明方法具体包括如下步骤:
1.将融合了生物素受体肽序列的衣壳蛋白序列和催化受体肽生物素化的酶序列同时插入到病毒全基因组，得到重组病毒质粒；
2.用重组病毒质粒转染宿主细胞，细胞全部出现病变时收集细胞上清液并纯化和浓缩得到重组病毒；
3.将重组病毒与细胞裂解液孵育至病毒液开始由浑浊变澄清，得到脱去部分包膜的病
毒；
4.将偶联有链酶亲和素的量子点与部分脱膜的重组病毒孵育以标记病毒，纯化得到核衣壳标记了量子点的包膜病毒。
[0007]对标记了量子点的病毒的纯化通过蔗糖密度梯度离心实现。
[0008]所述的酶序列为BirA酶序列。
[0009]本发明的实施例中，使用的包膜病毒为杆状病毒，宿主细胞为Sf9细胞。
[0010]将浓缩的重组杆状病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris缓冲溶液中孵育15min,得到脱去部分包膜的杆状病毒。[0011]将2 nM偶联有链霉未和素的量子点(SA-QDs)与脱去部分包膜的重组杆状病毒在4° C下孵育30分钟，即可实现量子点对重组杆状病毒核衣壳的标记。
[0012]本发明借助病毒在宿主细胞内的自我复制过程实现病包膜毒核衣壳的生物素化，继而用偶联有链酶亲和素的量子点进行反应，从而实现了量子点对包膜病毒核衣壳的标记。所构建的重组病毒可以作为毒种长期保存，通过简单扩增就可以得到子代病毒并直接用于标记。与其它的包膜病毒标记方法相比，本发明方法更加温和，无需通过剧烈的化学反应改造和标记病毒，保持了包膜病毒本身的侵染活性，且病毒内部核衣壳的标记不干扰包膜病毒表面对细胞受体的识别，有利于病毒对细胞的侵染过程的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为量子点标记病毒核衣壳的流程不意图。
[0014]图2为证明病毒核衣壳被生物素化的western blot图。
[0015]图3为重组杆状病毒被标记上量子点(A)及野生型病毒未被标记上量子点(B)的透射电子显微镜图，标尺为100 nm。
[0016]图4为标记了量子点的重组杆状病毒QDs-RBV和野生型杆状病毒WBV的一步生长曲线比较图。
[0017]图5为吸附在细胞表面的病毒与量子点的免疫荧光共定位图,标尺为10 μ mo【具体实施方式】
[0018]以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。
[0019]实施例1量子点标记重组杆状病毒核衣壳
下面以杆状病毒核衣壳的量子点标记为例，对本发明方法进行详细的说明。
[0020]一、方法
1.重组杆状病毒质粒的构建:利用杆状病毒表达系统，在杆状病毒全基因组里同时插入VP39AP序列(融合了生物素受体肽AP序列的杆状病毒衣壳蛋白VP39序列)和能够催化AP生物素化的BirA酶序列，从而得到具有重组杆状病毒全基因组的质粒。
[0021]2.获得纯化的重组杆状病毒RBV:用转染试剂将重组质粒转染到宿主Sf9细胞中，72小时后细胞全部出现病变时收集细胞上清液，4° C下通过15 min的5000 rpm离心获得第一代重组杆状病毒。用第一代重组杆状病毒侵染Sf9细胞,72小时后将所得上清液重复上述离心获得第二代病毒。用第二代病毒侵染Sf9细胞,72小时后将所得上清液重复上述离心、0.45 μ m滤膜过滤及2小时的100000 g超速离心，获得纯化后的浓缩病毒。
[0022]3.脱去病毒部分包膜:在浓缩的重组杆状病毒溶液中加入含有0.8% (质量比)NP40的10 mM pH 8.5的Tris缓冲溶液，孵育15min病毒液开始由浑浊变澄清时立即用150000 g超速离心I小时。用10 mM pH 7.0的PBS缓冲溶液重悬，得到脱去部分包膜的重组杆状病毒。
[0023]4.量子点标记重组杆状病毒核衣壳:将2 nM偶联有链霉未和素的量子点(SA-QDs)与部分脱去包膜的重组杆状病毒在4° C下孵育30分钟后，加入到w/v分别为65%、55%、45%、35%、25%、15%的蔗糖梯度中，进行3小时120000 g的超速离心。将收集的病毒条带溶解在PBS缓冲溶液中，再在120000 g下超速离心45分钟除去残余的蔗糖，得到纯化的核衣壳上标记了量子点的重组杆状病毒QDs-RBV。
[0024]二、结果
1.RBV的western blot表征:在本发明中，重组杆状病毒RBV通过转染构建的重组质粒而获得。采用杆状病毒衣壳蛋白VP39的抗体进行western blot实验，结果显示重组杆状病毒RBV样品同时在41KDa (VP39AP的大小)和39KDa (VP39的大小)处出现条带(图2A)，但野生型杆状病毒WBV样品仅在41KDa (VP39AP的大小)处出现条带(图2A);采用链霉亲和素标记的碱性磷酸酶进行western blot实验,仅重组杆状病毒RBV样品在41KDa处出现条带(图2B)，表明重组杆状病毒RBV的核衣壳被成功生物素化。 [0025]2.QDs-RBV的透射电子显微镜表征:为了更直观地证明RBV被标记上量子点，采用透射电子显微镜对经量子点标记的重组杆状病毒RBV (QDs-RBV)和与量子点孵育的野生型杆状病毒(WBV)进行了观察。结果表明量子点被连接在重组杆状病毒RBV上(图3A)，而WBV不能被量子点标记(图3B)，说明生物素化的重组杆状病毒核衣壳能够被量子点标记，且该标记是特异性的。
[0026]3.一步生长曲线表征:将QDs-RBV以感染复数M0I=5感染Sf9细胞，分别收集感染不同时间后的细胞上清液，采用半数组织培养感染剂量(TCID50 )方法测定每个上清液的滴度。以每个时间点平行测定三次的平均值作为纵坐标，时间点为横坐标绘制一步生长曲线，对野生型病毒WBV以相同操作绘制一步生长曲线作为对照(图4)。结果显示QDs-RBV与WBV的生长动力学行为一致,表明本发明方法能够保持病毒本身的侵染特性。
[0027]4.标记可靠性及标记效率的表征:为了进一步证明本发明方法能够实现对病毒核衣壳的标记，将感染复数M0I=5的QDs-RBV与Sf9细胞孵育并采用免疫荧光共定位实验进行观察。图5显示，QDs-RBV样品中量子点与病毒核衣壳蛋白VP39的共定位效率达到94%，而对照组WBV中没有量子点与VP39共定位现象，表明量子点被标记到了生物素化的重组杆状病毒核衣壳上，且该标记具有很强的特异性和很高的标记效率。
【权利要求】
1.一种量子点标记包膜病毒核衣壳的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)将融合了生物素受体肽序列的衣壳蛋白序列和催化受体肽生物素化的酶序列同时插入到病毒全基因组，得到重组病毒质粒； 2)用重组病毒质粒转染宿主细胞，细胞全部出现病变时收集细胞上清液并纯化和浓缩得到重组病毒； 3)将重组病毒与细胞裂解液孵育至病毒液开始由浑浊变澄清，得到脱去部分包膜的病毒; 4)将偶联有链酶亲和素的量子点与部分脱膜的重组病毒孵育以标记病毒，纯化得到核衣壳标记了量子点的包膜病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对标记了量子点的病毒的纯化通过蔗糖密度梯度离心实现。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的酶序列为BirA酶序列。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒为杆状病毒，宿主细胞为Sf9细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将浓缩的重组杆状病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris缓冲溶液中孵育15 min，得到脱去部分包膜的杆状病毒。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，将2nM偶联有链霉亲和素的量子点与脱去部分包膜的重组杆状病毒在4° C下孵育30分钟,实现量子点对重组杆状病毒核衣壳的标记。
【文档编号】C12N7/01GK103555681SQ201310592905
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】庞代文, 文莉, 林毅, 张志凌, 王汉中 申请人:武汉大学