一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法
【专利摘要】本发明提供一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，采用戊二醛键合法将神经氨酸酶固定在毛细管出口端。本发明首次采用戊二醛键合的方法将神经氨酸酶固定在毛细管内壁，该固定化酶微反应器可连续使用1个月以上；酶的活性没有明显降低，大大增强了酶的稳定性，从而很大程度地降低了酶的用量。且分离时，酶微反应器固定在毛细管出口端，缩短了样品分离的有效长度，大大提高了分离效率。本发明的制备方法步骤简单，操作方便，筛选速度快，可广泛应用于神经氨酸酶抑制剂的筛选。
【专利说明】—种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及流感病毒药物筛选领域，具体涉及一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法。
【背景技术】
[0002]在21世纪，流行性感冒仍然是危害人类身体健康的一大杀手。神经氨酸酶是一种从流感病毒表面发现的糖蛋白，它可以催化水解唾液酸受体的特异性连接，并释放出病毒颗粒感染新的细胞。同时，它还可以促进病毒颗粒迅速进入肺腺上皮细胞，导致严重的肺部疾病，从而导致患者死亡。由于其在流感病毒的复制、传播、感染及致病方面起着极为关键的作用，神经氨酸酶抑制剂的应用被认为是预防与治疗流感的主要途径。
[0003]目前，应用最多的神经氨酸酶抑制剂有奥司他韦和扎那米韦。神经氨酸酶抑制剂能同时对抗甲、乙型流感，且对禽流感及对人的传染均有效。但是，其耐药株的不断出现及全球传播，严重降低了其应用疗效。流感对人类生命的不断威胁使得新型酶抑制剂的开发成为研究热点。
[0004]传统的基于神经氨酸酶的抑制剂筛选方法通常是将底物与抑制剂混合，然后加入酶，孵育30-60 min，加入强碱停止反应，然后将反应的混合溶液采用化学发光或荧光检测。而化学发光及荧光检测存在着颜色淬灭及荧光淬灭效应，易导致假阳性结果。毛细管电泳分离方法因其高效快速的特点，广泛应用于酶抑制剂的筛选。而将毛细管电泳分离与固定化酶技术相结合，酶被固定在毛细管内壁后，酶可以反复使用，其稳定性也大大提高，从而降低酶的使用量；而且酶的反应与分离都在一根毛细管内进行，从而实现反应与分离一体化，大大提高了筛选效率；通过多根毛细管并列使用，还可实现高通量筛选。
[0005]开管固定化酶技术一般有两种:物理吸附法及共价键合法。物理吸附法固定条件温和，能大部分保留酶的活性，反应器`也可重复制备，不足之处在于反应器稳定性差，酶易被洗脱下来。而共价键合法，酶和载体结合牢固，反应器稳定性好。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，采用戊二醛键合法使神经氨酸酶与氨基化的硅烷化试剂及戊二醛发生键合反应，键合固定在毛细管内壁。
[0007]其具体技术方案为:
一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，制备方法包括如下步骤；
1)毛细管的预处理:毛细管依次采用IM NaOH冲洗2 h，H20冲洗30 min，纯甲醇冲洗30 min ；
2)将3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液从毛细管出口端采用50mbar压力进样6_18s，室温下放置1-2 h ;然后在毛细管入口端依次用纯甲醇、1120、？!1为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗，得到内壁涂敷有氨基化的硅烷化试剂的毛细管；3)配制戊二醛的Na2HPO4-NaH2PO4溶液:将戊二醛溶液加入pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，配制成含有体积百分比为2.5%-5%的戊二醛溶液，备用；
4)将上步制得的戊二醛溶液从步骤2)制得的毛细管的出口端采用在50mbar压力下进样6-18 s,放置1-3 h ;然后在毛细管入口端用pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗,将未反应的戊二醛冲出毛细管；
5)将0.1 U/mL的神经氨酸酶溶液从上步制得的毛细管的出口端采用50 mbar压力下进样6-18 S，放置30 min，然后将毛细管两端封口，于4°C条件下保存24 h，得到毛细管内固定化酶微反应器。
[0008]作为优选项:
所述毛细管为石英毛细管。
[0009]所述步骤2)中3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液中3-氨基丙基四乙氧硅烷的体积百分比为30%。
[0010]所述步骤2)中MeOH冲洗时间为5 min，H2O冲洗时间为3 min，pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗时间为5 min。
[0011]所述步骤4)中磷酸缓冲溶液冲洗时间为10 min。
[0012]所述石英毛细管柱 长为35.5-40.5 cm。
[0013]本发明所述的细管内固定化酶微反应器可应用于在线筛选神经氨酸酶抑制剂，所述应用的方法为:待筛选化合物用甲醇配成I mg/mL的样品溶液，取一定体积，分别与底物(溶解在50 mM pH5.0 NaAc-HAc缓冲溶液中)混合。混合后，底物与待筛选化合物的终浓度分别为120 μ M和60 μ Μ。将底物或者底物与待筛选化合物的混合物分别在50 mbar压力下进样6 S，进入毛细管出口端，孵育5 min，使其与出口端的固定化酶反应，比较底物或者底物与待筛选化合物的混合物进样后产生的产物的峰面积大小，若混合物进样后，峰面积减小，则说明待筛选化合物对神经氨酸酶有抑制效果。
[0014]本发明首次采用戊二醛键合的方法将神经氨酸酶固定在毛细管内壁，使毛细管柱内酶的反应次数大大增加，该固定化酶微反应器可连续使用I个月以上；酶的活性没有明显降低，大大增强了酶的稳定性和使用寿命，从而很大程度地降低了酶的用量。且分离时，酶微反应器固定在毛细管出口端，缩短了样品分离的有效长度，大大提高了分离效率，与溶液中的筛选方法比，很大程度地降低了试剂用量和筛选成本。
[0015]本发明的制备方法步骤简单，操作方便，筛选速度快，可广泛应用于神经氨酸酶抑制剂的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明毛细管内固定化酶微反应器的示意图。
[0017]图2为补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚对神经氨酸酶的抑制实验结果。
[0018]其中:曲线I为纯底物进样后得到的电泳图谱；
曲线2为底物与补骨脂二氢黄酮甲醚混合进样后得到的电泳图谱；
曲线3为底物与补骨脂乙素混合进样后得到的电泳图谱；
曲线4为底物与补骨脂甲素混合进样后得到的电泳图谱。【具体实施方式】
[0019]本发明通过下列非限制的实施实例进一步加以说明，但非用以限制本发明的范围。
[0020]实施例1:
选用内径为50 μ m的石英毛细管，管长35.5 cm，首先用I M NaOH冲洗2 h，H2O冲洗30 min，纯甲醇冲洗30 min ;然后将毛细管固定在毛细管电泳仪上，将体积百分比为30%为3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样6s,室温下放置I h后，然后从毛细管入口端依次用纯甲醇冲洗5 min, H2O冲洗3 min,PH7.0 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;接着将2.5%的戊二醛溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样6 s,室温下放置I h后,然后从毛细管入口端用pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;最后将0.1 U/mL的神经氨酸酶溶液，从毛细管出口端采用50 mbar压力进样6 s,室温下放置30 min后,放入4°C冰箱内保存24 h。
[0021]将底物分别与补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚混合，底物终浓度为120 μ M，筛选化合物的终浓度为60 μ Μ，在50 mbar压力下进样6 S，使混合物进入毛细管出口端，孵育5 min，使其与出口端的固定化酶反应，观察产生的产物的峰面积变化。三个筛选的化合物与底物混合后，产生的产物的峰面积明显下降，说明其对神经氨酸酶有明显的抑制作用，结果见图2。
[0022]实施例2:
选用内径为50 μ m的石英毛细管·，管长38.5 cm，首先用I M NaOH冲洗2 h，H20冲洗30 min,纯甲醇冲洗30 min ;然后将毛细管固定在毛细管电泳仪上,将体积百分比为30%为3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样12s，室温下放置I h后,然后从毛细管入口端依次用纯甲醇冲洗5 min, H2O冲洗3 min, pH为7.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;接着将3%的戊二醛溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样12s，室温下放置2 h后，然后从毛细管入口端用pH为7.0 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;最后将0.1 U/mL的神经氨酸酶溶液,从毛细管出口端采用50 mbar压力进样12s，室温下放置30 min后，放入4°C冰箱内保存24 h。
[0023]将底物分别与补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚混合，底物终浓度为120 μ Μ，筛选化合物的终浓度为60 μ Μ，在50 mbar压力下进样12 s,使混合物进入毛细管出口端，孵育5 min，使其与出口端的固定化酶反应，观察产生的产物的峰面积变化。三个筛选的化合物与底物混合后，产生的产物的峰面积明显下降，说明其对神经氨酸酶有明显的抑制作用。
[0024]实施例3:
选用内径为50 μ m的石英毛细管，管长40.5 cm，首先用I M NaOH冲洗2 h，H20冲洗30 min,纯甲醇冲洗30 min ;然后将毛细管固定在毛细管电泳仪上,将体积百分比为30%为3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样18 S，室温下放置2 h后,然后从毛细管入口端依次用纯甲醇冲洗5 min, H2O冲洗3 min, pH为7.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;接着将5%的戊二醛溶液从毛细管出口端采用50 mbar压力进样18s，室温下放置3 h后，然后从毛细管入口端用pH为7.0 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗5 min ;最后将0.1 U/mL的神经氨酸酶溶液,从毛细管出口端采用50 mbar压力进样18s，室温下放置30 min后，放入4°C冰箱内保存24 h。
[0025]将底物分别与补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚混合，底物终浓度为120 μ Μ，筛选化合物的终浓度为60 μ Μ，在50 mbar压力下进样18 s,使混合物进入毛细管出口端，孵育5 min，使其与出口端的固定化酶反应，观察产生的产物的峰面积变化。三个筛选的化合物与底物混合后，产生的产物的峰面积明显下降，说明其对神经氨酸酶有明显的抑制作用。`
【权利要求】
1.一种毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于:制备方法包括如下步骤； 1)毛细管的预处理:毛细管依次采用IM NaOH冲洗2 h，H20冲洗30 min，纯甲醇冲洗30 min ； 2)将3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液从毛细管出口端采用50mbar压力进样6_18s，室温下放置1-2 h ;然后从毛细管入口端依次用纯甲醇、1120、？!1为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗，得到内壁涂敷有氨基化的硅烷化试剂的毛细管； 3)配制戊二醛的Na2HPO4-NaH2PO4溶液:将戊二醛溶液加入pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中，配制成含有体积百分比为2.5%-5%的戊二醛溶液，备用； 4)将上步制得的戊二醛溶液从步骤2)制得的毛细管的出口端采用在50mbar压力下进样6-18 s,放置1-3 h ;然后从毛细管入口端用pH为7.0的磷酸缓冲溶液冲洗,将未反应的戊二醛冲出毛细管； 5)将0.1 U/mL的神经氨酸酶溶液从上步制得的毛细管的出口端采用50 mbar压力下进样6-18 S，放置30 min，然后将毛细管两端封口，于4°C条件下保存24 h，得到毛细管内固定化酶微反应器。
2.如权利要求1所述的毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于:所述毛细管为石英毛细管。
3.如权利要求1所述的毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中3-氨基丙基四乙氧硅烷的甲醇溶液中3-氨基丙基四乙氧硅烷的体积百分比为30%。`
4.如权利要求1所述的毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中MeOH冲洗时间为5 min, H2O冲洗时间为3 min, pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液冲洗时间为5 min。
5.如权利要求1所述的毛细管内固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于:所述步骤4)中磷酸缓冲溶液冲洗时间为10 min。
6.如权利要求1所述的神经氨酸酶微反应器的制备方法，其特征在于:所述石英毛细管柱长为35.5-40.5 cm。
【文档编号】C12Q1/34GK103627634SQ201310629452
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月2日 优先权日:2013年12月2日
【发明者】陈子林, 赵海燕 申请人:武汉大学