一种马属动物卵母细胞体外培养液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种马属动物卵母细胞体外培养液，其中，培养液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种；其配制方法包括：将乳酸钠混合液置于37℃的恒温箱中0.5-6小时后，备用，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即得到培养液。适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。本发明的有益效果是：具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。
【专利说明】—种马属动物卵母细胞体外培养液
【技术领域】
[0001]本发明属于动物胚胎移植领域，特别是涉及一种马属动物卵母细胞体外培养液。【背景技术】
[0002]胚胎移植又称受精卵移植，俗称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。胚胎移植的基本程序包括供体超排与授精、受体同期发情处理、采卵、检卵和移植。
[0003]采卵又称胚胎回收，是指从供体收集胚胎的方法，分为手术法和非手术法两种。非手术法比手术法简单易行，而且对生殖器官的伤害程度较小，因此在生产中多采用此法。培养液是采卵过程中，用于把胚胎从供体生殖道中冲洗出来的液体。培养液多数为组织培养液，目前国内常用的培养液主要有杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)、布林斯特氏液、合成输卵管液(S0F)、惠屯氏液、Ham’s F-110以及TCM-199`。上述几种液体均存在药品来源困难，价格昂贵，配制步骤繁琐且需现用现配等问题，为胚胎移植的规模化生产带来极大的不便。
【发明内容】
[0004]为了解决传统的培养液药品来源困难、价格昂贵、配制步骤繁琐且需现用现配等问题，本发明提供了一种适用于规模化生产的马属动物非手术法胚胎移植用培养液及其配制方法和应用。
[0005]为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物卵母细胞体外培养液，所述培养液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清中的一种、两种或三种。
[0006]所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。
[0007]所述培养液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%-14%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。
[0008]所述培养液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%_10%和/或灭活马血清1%-10%。其中，所述血清白蛋白、所述犊牛血清以及所述灭活马血清的百分比为体积百分比。
[0009]所述乳酸钠混合液中各组分的含量为?每1000ml混合液中含有乳酸钠l_7g、氯化钠l_5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。
[0010]所述乳酸钠混合液中各组分的含量优选为?每1000ml混合液中含有乳酸钠3_7g、氯化钠2-5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.lg。
[0011]所述乳酸钠混合液中各组分的含量还可以优选为:每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.lg、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。
[0012]为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种马属动物卵母细胞体外培养液的配制方法，包括:
(1)按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中0.5-6小时后,备用；
(2)称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤(1)中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；
(3)准备冲卵前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到培养液。
[0013]本发明的马属动物培养液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。
[0014]本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:本发明以乳酸钠混合液作为主液，可提前配制待用，使用前只需向主液中加入适量抗生素及牛血清白蛋白或犊牛血清或灭活马血清即可。具有取材方便、价格低廉、配制简单、使用方便等优点，非常适用于马属动物非手术法胚胎移植的规模化生产，有利于胚胎移植技术的推广应用。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明做进一步描述。
[0016]实施例1
一种马属动物卵母细胞体`外培养液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠混合液含有50万单位青霉素、50万单位链霉素和体积百分比为10%的犊牛血清。
[0017]称取乳酸钠27g、氯化钠16g、氯化钾23g、氯化钙5.5g和氯化镁1.6g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中6小时后，备用；称取黄芪多糖0.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；准备冲卵前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及犊牛血清，即可得到培养液。
[0018]使用本实施例培养液对非手术法牛胚胎移植进行冲卵。
[0019]实施例2
一种马属动物卵母细胞体外培养液，包括5000ml乳酸钠混合液作为主液，每1000ml乳酸钠林格注射液含有100万单位青霉素、120万单位链霉素和体积百分比为3%的灭活马血清。
[0020]称取乳酸钠10.5g、氯化钠6g、氯化钾13.5g和氯化钙9g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中3小时后，备用；称取黄芪多糖1.4g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；准备冲卵前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到培养液。
[0021]本实施例培养液应用于非手术法马胚胎移植的冲卵。
[0022]实施例3
一种马属动物卵母细胞体外培养液，包括4 O O O m I乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有80万单位青霉素、80万单位链霉素和体积百分比为5%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g。
[0023]称取乳酸钠26g、氯化钠10.8g、氯化钾21g和氯化钙16.8g，加入4000ml蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中I小时后，得到乳酸钠混合液以待备用；准备冲卵前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到培养液。
[0024]本实施例培养液应用于非手术法马胚胎移植的冲卵。
[0025]实施例4
一种马属动物卵母细胞体外培养液，包括5 O O O m I乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有60万单位青霉素、90万单位链霉素和体积百分比为8%的灭活马血清；其中，乳酸钠混合液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g、氯化镁2.25g和黄芪多糖0.25g。
[0026]称取乳酸钠25.0g、氯化钠20.0g、氯化钾25g、氯化钙7.5g和氯化镁2.25g，加入5000ml蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中I小时后，备用；称取黄芪多糖0.25g放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入到备用的混合液中，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液；准备冲卵前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及灭活马血清，即可得到培养液。
[0027]本实施例培养液应用于非手术法马胚胎移植的冲卵。
[0028]实施例5
一种马属动物卵母细胞体外培养液，包括4 O O O m I乳酸钠混合液作为主液，其中每1000ml乳酸钠混合液中含有150万单位青霉素、60万单位链霉素和体积百分比为0.35%的牛血清白蛋白；其中，乳酸钠`混合液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾Hg、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g。
[0029]称取乳酸钠16.8g、氯化钠8.0g、氯化钾Hg、氯化钙2.8g和氯化镁1.08g,加入4000ml蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中I小时后，得到乳酸钠混合液，以待备用；准备冲卵前，按照组分含量，向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白，即可得到培养液。
[0030]本实施例培养液应用于非手术法牛胚胎移植的冲卵。
[0031]对比实验:
选取9头正常的供体母牛分成3组，在母牛发情后第七天，分别使用实施例1得到的培养液(实施例组I)、实施例5得到的培养液(实施例组5)和传统培养液(对照组I)进行冲卵，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。I周后统计冲卵及移植数，并对受体进行观察，直至生产。供体母牛冲卵及胚胎移植效果如表1所示。
[0032]选取80匹正常的供体母马分成4组，在母马发情后第七天，分别使用实施例2-4得到的培养液(实施例组2-4)和传统培养液(对照组2)进行冲卵，并保存胚胎30min后进行检卵和移植。I周后统计冲卵及移植数，并对受体进行观察，直至生产。供体母马冲卵及胚胎移植效果如表2所示。
[0033]其中，传统培养液选取TCM-199培养液，需使用前现场配制。
[0034]表1供体母牛冲卵及胚胎移植效果对照表
【权利要求】
1.马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述培养液包括乳酸钠混合液、青霉素、链霉素，以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种、两种或三种。
2.根据权利要求1所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述乳酸钠混合液包括乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和黄芪多糖中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述培养液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素30-180万单位、链霉素20-200万单位，以及牛血清白蛋白0.05%-1.5%、犊牛血清0.5%-15%和/或灭活马血清0.5%_14%。
4.根据权利要求1或2所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述培养液中各组分的含量为:每1000ml乳酸钠混合液中含有青霉素50-150万单位、链霉素50-150万单位，以及牛血清白蛋白0.1%-0.9%、犊牛血清1%-10%和/或灭活马血清1%_10%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为:每1000ml混合液中含有乳酸钠l_7g、氯化钠l_5g、氯化钾2-7g、氯化钙0.5-2g、氯化镁0.05-0.5g和黄芪多糖0.01-0.3g。
6.根据权利要求1-5任一项所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为:每1000ml混合液中含有乳酸钠3-7g、氯化钠2_5g、氯化钾3-7g、氯化钙0.5-1.5g、氯化镁0.1-0.4g和黄芪多糖0.01-0.lg。
7.根据权利要求1-6任一项所述的马属动物卵母细胞体外培养液，其特征在于，所述乳酸钠混合液中各组分的含量为:每1000ml混合液中含有乳酸钠5.4g、氯化钠3.2g、氯化钾4.6g、氯化钙1.lg、氯化镁0.32g和黄芪多糖0.08g。
8.—种如权利要求1-7任一项所述的马属动物卵母细胞体外培养液的配制方法,其特征在于，所述配制方法包括: (1)按照各组分的含量称取乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁，并加入蒸馏水混合，置于37°C的恒温箱中0.5-6小时后,备用； (2)称取黄芪多糖放入无菌烧杯中，向无菌烧杯中加入步骤(1)中得到的混合液，搅拌使黄芪多糖充分溶解，得到乳酸钠混合液； (3)准备冲卵前，按照组分含量向乳酸钠混合液中加入青霉素、链霉素以及牛血清白蛋白、犊牛血清和灭活马血清中的一种或两种或三种，即可得到培养液。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的马属动物卵母细胞体外培养液的应用，其特征在于，所述培养液适用于马、牛、驴的非手术法胚胎移植技术。
【文档编号】C12N5/075GK103805558SQ201310645076
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】张建军, 董斌, 刘海兵 申请人:青岛德瑞骏发生物科技有限公司, 伊犁德瑞骏发生物科技有限公司, 青岛德瑞鳌蓝马术有限公司