扁穗牛鞭草isap指纹图谱的建立方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用。本发明利用ISAP分子标记技术来构建不同扁穗牛鞭草种质的DNA指纹图谱，有利于对无性系扁穗牛鞭草进行快速、准确的鉴定，与常规的形态检验与生化检验相比，不受生长环境和季节的影响，结果更可靠，省时省力；本发明具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISAP分子标记技术在准确、快速、简便的品种鉴定中更广泛地应用，同时应用该方法，对扁穗牛鞭草无性系种质的遗传变异进行鉴定，从而实现对扁穗牛鞭草无性系种质变异的早期筛选及新品种选育的需要。
【专利说明】扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用。
【背景技术】
[0002]扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa L.)是禾本科牛鞭草属多年生暖季型优良饲草，茎叶量多，草质柔嫩，营养丰富，富含果胶、植物胶汁、藻类多糖和部分纤维素等水溶性纤维素而入口微甜，既可放牧利用，又可调制干草、青贮。牲畜喜食用，主要靠地上茎繁殖，具有适应性广、优质高产、耐刈割、适口性好、高抗及竞争性强的优点，对退耕还草、种草养畜、水土保持及环境绿化等具有重要应用价值。
[0003]随着分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记和基因标记技术的建立和成熟，为发展简便、快速、准确的种质鉴定技术提供了有效手段。ISAP(intron sequenceamplified polymorphism)标记技术一种基于基因中内含子序列的功能型分子标记,利用内含子剪接位置的保守一致序列作为其引物的核心序列，其上下游引物均为18bp，上下游引物间通过组合配对的方式作为扩增的引物对，对真核生物的基因序列进行扩增的分子标记。ISAP标记通过对基因序列的扩增而与表达序列紧密连锁，可以被广泛而高效地应用于高密度图谱的构建，QTL检测，基因定位，图位克隆以及分子标记辅助育种等。
[0004]由于扁穗牛鞭草为无性繁殖，其品种选育一般通过选择具有优良遗传变异的无性系材料。这也为其品种或优良品系的知识产权保护带来挑战。DNA指纹图谱技术正是基于每种植物及其品种都有各自特定的性状和相应的DNA序列差异而建立的应用性遗传分析方法，通过对已有各品种或品系DNA进行扫描并编码登记形成各自独特的指纹图谱鉴定某个品种或品系的真伪和特异性。开展扁穗牛鞭草种质资源的DNA指纹图谱构建研究，可以有效地解决同种异名、同名不同质和疑似近似品种的管理问题，为其品种审定和保护提供重要理论参考依据。目前，未见ISAP标记技术在扁穗牛鞭草无性系DNA指纹图谱方面的研究，也没有建立一种完善的扁穗牛`鞭草DNA指纹图谱的构建方法。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法及其应用。
[0006]为实现上述目的，本发明技术方案如下:
[0007]扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，包括如下步骤:
[0008]1.DNA提取:采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因组DNA ；
[0009]2.1SAP引物序列的PCR扩增:在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增，对72对引物进行多态性筛选；
[0010]3.1SAP-PCR产物的电泳检测:用6 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳仪上电泳，银染法后拍照，得照片；
[0011]4.数据统计及分析:在相同迁移位置，人工记录每个引物的扩增片段，有带记为1，无带记为0，形成原始“0，I” 二元数据矩阵；[0012]5.DNA指纹图谱的构建:根据照片上引物扩增情况，挑取具有代表性的ISAP多态性带，绘制扁穗牛鞭草的DNA指纹图谱。
[0013]所述步骤I中DNA提取包括如下步骤:
[0014](I)取适量植物组织置于研钵中，加入约30mL的液氮，捣碎叶片，等液氮快挥发完时，快速研磨到粉状，把粉末转移到有标记的2.0ml无菌离心管中；加入800μ L65°C预热的DNA提取液于2.0ml无菌离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65°C水浴20_60min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；取出样品管按体积比24: I加入700 UL氯仿/异戍醇颠倒充分混匀后，12000rpm离心5min,得上清液；
[0015](2)将步骤(1)所得的上清液吸取到一个新的1.5mL无菌离心管；缓慢加入预冷的异丙醇，加入量按吸取上清液体积的2 / 3计，上下摇动离心管，注意观察DNA将从溶液中析出，_20°C放置30min，使得DNA成团，12000rpm离心5min，将析出的白色絮状DNA沉淀转入新的1.5mL无菌离心管；加入75 %的乙醇溶液900 μ L，清洗2_3次，混匀，4°C, 12000rpm离心6min,倒掉上清液,然后用无水乙醇洗漆一次,室温下放置数分钟；加入500 μ L的TE缓冲液，37°C保温Ih以除去DNA中的RNA ;在无菌离心管加入500 μ L苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，氯仿和异戊醇的混合物各抽提一次，充分混匀，在室温下12000rpm，离心5min ；
[0016](3)取上清液于另已1.5ml无菌离心管中，加入200 μ L5moI / L的NaCl和750 μ L饱和水乙醚,轻摇5min,在室温下12000rpm,离心10min ;小心除去上层乙醚,将下层液体移到鑫的1.5ml无菌离心管中，加入I / 10体积的NaAc和两倍体积无水乙醇，_20°C沉淀DNAlh ;12000rpm离心10min，沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗涤I次，室温放置5min ；
[0017]干燥后加入150-200 μ L双蒸水或0.1 XTE缓冲液，放在4°C冰箱中保存；
[0018](4)采用紫外分光光度计法检测DNA的含量，检测260、280nm处的OD值，计算得出DNA的含量。如0D260 / 0D280=1.8左右，DNA较为纯净；〈1.8，则有蛋白污染；>1.8，则有RNA污染。同时，还可进一步用1%的琼脂糖电泳检测DNA的质量，以得到非常直观的效果O
[0019]所述DNA 提取为 2% CTAB ;1.4mol / LNaCl ；20mmol / L EDTAPH8.0 ; IOOmmol /LTris-HClPH8.0 ；2% β -巯基乙醇。
[0020]所述TE 缓冲液为 IOmmol / L Tris-HCl, lmmol / LEDTA, ΡΗ8.0)溶解，加入3 μ LRNAase(IOmg / ml。
[0021]所述步骤⑵中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25: 24:1。
[0022]所述步骤⑵氯仿:异戊醇的体积比为24: I。
[0023]本发明的有益效果为:
[0024](I)本发明利用ISAP分子标记技术来构建不同扁穗牛鞭草种质的DNA指纹图谱，有利于对无性系扁穗牛鞭草进行快速、准确的鉴定，与常规的形态检验与生化检验相比，不受生长环境和季节的影响，结果更稳定、可靠，且省时省力；构建DNA指纹普和鉴定技术使ISAP分子标记技术在植物品种鉴定、亲缘关系分析、植物种质资源创新和分子标记辅助育种中的广泛推广应用打下良好的基础；
[0025](2)采用本发明构建的扁穗牛鞭草DNA指纹图谱，涵盖了我国西南地区大部分种质资源，具有一定的广泛性，同时，对于鉴定出的新品种，可以进一步补充完善扁穗牛鞭草种质的指纹图谱，以满足新品种选育的需要。
[0026](3)本发明具有操作简单、直观实用等特点，可以促进ISAP分子标记技术在准确、快速、简便的品种鉴定中更广泛地应用，同时应用该方法，对扁穗牛鞭草无性系种质变异品种进行鉴定，从而实现对扁穗牛鞭草无性系种质变异的早期筛选及新品种选育的需要。
【具体实施方式】
[0027]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]实施例1
[0029]1.材料来源
[0030]试验材料为26份扁穗牛鞭草无性系种质(表1)，包括“重高”、“广益”和“雅安”3个国审品种、栽培品系和野生材料，具有较好的代表性。
[0031]表1扁穗牛鞭草无性系来源
[0032]
【权利要求】
1.扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: (1).DNA提取:采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因组DNA ； (2).ISAP引物序列的PCR扩增:在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增，对72对引物进行多态性筛选； (3).1SAP-PCR产物的电泳检测:用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳仪上电泳，银染法后拍照，得照片； (4).数据统计及分析:在相同迁移位置，人工记录每个引物的扩增片段，有带记为1，无带记为0，形成原始“0，I” 二元数据矩阵； (5).DNA指纹图谱的构建:根据照片上引物扩增情况，挑取具有代表性的ISAP多态性带，绘制扁穗牛鞭草的DNA指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤I中DNA提取包括如下步骤: (1)取适量植物组织置于研钵中，加入约30mL的液氮，捣碎叶片，等液氮快挥发完时，快速研磨到粉状，把粉末转移到有标记的2.0ml无菌离心管中；加入800 μ L65°C预热的DNA提取液于2.0ml无菌离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管置于65°C水浴20_60min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；取出样品管按体积比24: I加入700 UL氯仿/异戊醇颠倒充分混匀后，12000rpm离心5min,得上清液； (2)将步骤(1)所得的上清液吸取到一个新的1.5mL无菌离心管；缓慢加入预冷的异丙醇，加入量按吸取上清液体积的2 / 3计，上下摇动离心管，注意观察DNA将从溶液中析出，_20°C放置30min，使得`DNA成团，12000rpm离心5min，将析出的白色絮状DNA沉淀转入新的1.5mL无菌离心管；加入75%的乙醇溶液900 μ L，清洗2_3次，混匀，4°C，12000rpm离心6min，倒掉上清液，然后用无水乙醇洗涤一次，室温下放置数分钟；加入500 μ L的TE缓冲液，37°C保温Ih以除去DNA中的RNA ;在无菌离心管加入500 μ L苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，氯仿和异戊醇的混合物各抽提一次，充分混匀，在室温下12000rpm，离心5min ； (3)取上清液于另已1.5ml无菌离心管中，加入200 μ L5moI / L的NaCl和750 μ L饱和水乙醚，轻摇5min,在室温下12000rpm,离心10min ;小心除去上层乙醚,将下层液体移到鑫的1.5ml无菌离心管中，加入I / 10体积的NaAc和两倍体积无水乙醇，_20°C沉淀DNAlh ；12000rpm离心10min,沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗漆I次,室温放置5min ； 干燥后加入150-200 μ L双蒸水或0.1 X TE缓冲液，放在4°C冰箱中保存； (4)采用紫外分光光度计法检测DNA的含量，检测260、280nm处的OD值，计算得出DNA的含量。如0D260 / 0D280=1.8左右，DNA较为纯净；〈1.8，则有蛋白污染；>1.8，则有RNA污染。同时，还可进一步用1%的琼脂糖电泳检测DNA的质量，以得到非常直观的效果。
3.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述 DNA 提取为 2 % CTAB ；1.4mol / LNaCl ；20mmol / L EDTAPH8.0 ;IOOmmol /LTris-HClPH8.0 ；2% β -巯基乙醇。
4.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述TE缓冲液为 IOmmol / L Tris-HCl, lmmol / LEDTA, ΡΗ8.0)溶解，加入 3 μ LRNAase (IOmg /ml ο
5.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤(2)中苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25: 24:1。
6.根据权利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述步骤⑵氯仿:异戊醇的体积比为24:1。
7.如 权利要求1所述扁穗牛鞭草ISAP指纹图谱的建立方法的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103866021SQ201410091274
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】马啸, 张新全, 郭志慧, 彭燕, 刘伟, 闫艳红, 周朝杰, 顾晓燕, 刘新 申请人:四川农业大学