一种检测egfr基因858密码子突变的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测EGFR基因858密码子突变的试剂盒。本发明联合采用ARMS和PNA钳制PCR两种技术，建立了检测EGFR基因858密码子突变的实时PCR定量方法。本发明方法灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1-2拷贝，特别适合于低含量突变样本（如血清或血浆）的检测；与测序法相比，本发明方法的结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；本发明方法检测速度快，适用于高通量的样本检测。
【专利说明】—种检测EGFR基因858密码子突变的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体是涉及一种用于定性或定量检测血清或血浆中是否含有EGFR858密码子突变型基因的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]EGFR表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1 (HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上。目前已经报道不下30种EGFR基因突变与药物反应性有关，但绝大部分是外显子19上的缺失突变和外显子21上L858R的点突变。通过对患者EGFR基因的突变检测，可辅助临床医生筛选可受益于分子靶向抗肿瘤药物如易瑞沙、特罗凯和凯美纳等的肿瘤患者。
[0003]临床上大都采用病理组织标本提取DNA进行EGFR检测，但晚期肺癌病人有时无法获取肿瘤标本。很多权威研究认为肿瘤组织存在异质性，肿瘤组织不同部位的体细胞基因突变谱并不相同，血清或血浆肿瘤基因突变检测方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差，已逐渐在临床上推广应用。近年来的研究还表明，癌症病人的血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DNA，以及分析血浆中肿瘤基因含量的变化，可以为肿瘤的疗效监测及预后提供重要的参考。
[0004]采用血清或血浆检测EGFR基因突变检测的是来源于肿瘤组织的体细胞突变，不同于检测一般性的遗传突变；在血清或血浆中存在大量野生型DNA，相当一部分患者其血清或血浆的EGFR基因突变比例在1%-0.01%之间。目前临床上逐渐采用的突变基因特异扩增PCR法(ARMS)对于EGFR基因858密码子点突变的检测灵敏度一般只能达到1%，不能很好地适用于血 清或血浆EGFR基因突变检测。ARMS也称作等位基因特异性PCR(AlIeleSpecific PCR，AS-PCR)，其原理是PCR引物的3’端末位碱基与其模板DNA存在错配时，一般将导致扩增效率急剧下降，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增信号，从而检测出突变。
[0005]肽核酸(P印tide Nucleic Acid, PNA)由丹麦科学家在1991年最先先成。PNA是具有类多肽骨架的DNA类似物，主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA/DNA杂交的TM值比DNA/DNA高15°C，但PNA与DNA若有单碱基错配，则结合能力很弱或不结合。PNA钳制PCR检测基因突变的原理是:通过设计一条涵盖突变位点的15-20bp长的PNA，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增可受到强烈地抑制作用；而当PCR的模板为突变型时，PNA与其存在错配，杂交能力消失，引物延伸不受影响，扩增可以正常进行。据文献报道，采用PNA钳制PCR技术检测基因突变的灵敏度一般在1%左右，同样不能较好地适用于血清或血浆EGFR基因突变检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种 检测EGFR基因858密码子突变的试剂盒及其引用。[0007]为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为:
[0008]所述检测EGFR基因858密码子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下成分:
[0009]扩增野生型和突变型EGFR基因的通用引物对:
[0010]上游引物5，-ACACCGCAGCATGTCAAGAT-3，(SEQ ID NO:1),
[0011]下游引物5，-CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’ (SEQ ID N0:2)；
[0012]扩增突变型EGFR基因的ARMS引物:
[0013]5’ -AAGATCACAGATTTTGGGCG-3’ (SEQ ID NO:3);
[0014]与野生型EGFR基因配对的PNA:
[0015]NH2-GTTTGGCCAGCCCAAA-⑶OH (SEQ ID NO:4)。
[0016]上述这些引物都可用于制备检测EGFR基因858密码子突变试剂。
[0017]下面对本发明作进一步说明:
[0018]本发明设计了一对用于扩增野生型和突变型EGFR基因的PCR通用引物，一条用于扩增EGFR基因858密码子突变基因的ARMS引物，一条用于阻滞野生型EGFR基因的扩增的PNA ;利用PCR通用弓丨物、ARMS弓丨物和PNA，使用含有SYBR染料的反应液，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，根据CT值，得出标准曲线，从而计算出样本中的突变EGFR
基因含量。
[0019]所述PCR通用引物对由上游引物和下游引物组成，上游引物为5’-ACACCGCAGCATGTCAAGAT-3’(SEQ ID NO: 1)，下游引物为 5’-CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’(SEQ ID N0:2)，扩增片段长95bp;所述ARMS引物为5’-AAGATCACAGATTTTGGGCG-3’(SEQ IDNO:3)，与下游引物 5’-CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’(SEQ ID NO:2)组成扩增突变型 EGFR 基因的PCR引物对，扩增片段长80bp ;所述PNA长16bp，序列为NH2-GTTTGGCCAGCCCAAA-C00H(SEQ ID N0:4)。
[0020]本发明的检测EGFR基因858密码子突变的具体过程为:
[0021 ] (I)提取待测样本DNA
[0022]采用商品化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考该试剂盒说明书。
[0023](2) EGFR基因野生型及突变型质粒模板标准品的制备
[0024]采集含有EGFR野生型及其858密码子突变型的样品，EGFR野生型的序列如SN0:5所示，突变型的序列如SEQ ID NO: 6所示，提取DNA，野生型DNA用SEQ ID NSEQ ID N0:2所示的引物对进行PCR扩增，PCR反应参数及体系为:
[0025]95oC30s ；95oC5s, 75oC20s, 55oC30s，进行 40 个循环，
[0026]
【权利要求】
1.一种检测EGFR基因858密码子突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下成分: 扩增野生型和突变型EGFR基因的通用引物对: 上游引物 5 ’ -ACACCGCAGCATGTCAAGAT-3，， 下游引物 5’ -CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’ ； 扩增突变型EGFR基因的ARMS弓丨物:
5’ -AAGATCACAGATTTTGGGCG-3’ ； 与野生型EGFR基因配对的PNA:
nh2-gtttggccagcccaaa-cooh。
2.如权利要求1所述引物在制备检测EGFR基因858密码子突变试剂中的应用；所述引物具体为: 扩增野生型和突变型EGFR基因的通用引物对: 上游引物 5 ’ -ACACCGCAGCATGTCAAGAT-3，， 下游引物 5’ -CTCCTTACTTTGCCTCCTTCT-3’ ； 扩增突变型EGFR基因的ARMS弓丨物:
5’ -AAGATCACAGATTTTGGGCG-3’ ； 与野生型EGFR基因配对的PNA:
nh2-gtttggccagcccaaa -cooh。
【文档编号】C12Q1/68GK103882137SQ201410133017
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】张戈 申请人:长沙三济生物科技有限公司