用于培养微生物表达肝素酶iii的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于培养微生物表达肝素酶III的培养基。该培养基，是含有5-25g/L酵母提取物，0.5-20g/L葡萄糖，0.5％-2.5％(质量百分比)乙醇的培养基。所述培养基中还含有10.0-25.0g/L?Na2HPO4.12H2O，1.0-5.0g/L?KH2PO4，0.1-1.0g/L?NaCl，0.5-5.0g/L?NH4Cl。重组肝素酶能够在上述培养基中高量表达，最高的肝素酶酶活达1776.3IU/L发酵液。该培养基大大降低了肝素酶的生产成本，对肝素酶的应用尤其是酶法制备低分子量肝素具有极其显著的经济意义。
【专利说明】用于培养微生物表达肝素酶111的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于培养微生物表达肝素酶III的培养基，具体涉及一种用于培养微生物表达肝素酶III融合蛋白的培养基。
【背景技术】
[0002]肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素(heparin)或者硫酸乙酰肝素(heparansulfate)的多糖裂解酶，能特异性地断裂肝素和类肝素链上具有特定修饰的不同序列，产生不同的寡糖片段。肝素酶具有许多重要用途，包括体内循环中肝素的消除，肝素精确结构的确定，肝素抗凝机理和肝素结构与功能的研究，制备低分子量肝素及抗肿瘤药物等。
[0003]肝素酶存在于许多种微生物中，包括棒杆菌(Corynebacterium sp.)、鞘胺醇杆菌(Sphingobacterium sp.)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、环状芽抱杆菌(Bacilluscirculans)、解肝素拟杆菌(Prevotella heparinolytica)、幾便拟杆菌(Bacteroidesstercoris HJ-15)和肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。
[0004]来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I (EC4.2.2.7)、肝素酶
II(No EC code)和肝素酶 III (EC 4.2.2.8) (Robert J.Linhardt et al.，Purification andcharacterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC 1992Vol.267:24347-24355)。肝素酶I 主要作用于肝素，分子量43kDa，肝素酶II作用于肝素和硫酸乙酰肝素，分子量85kDa，肝素酶III主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量73kDa。其中，对肝素酶I (hepA)的研究较多，而对肝素酶II和III的研究相对较少。
[0005]硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是一种结构复杂的酸性蛋白聚糖，参与体内一系列的生理和病理过程，如胚胎发育、神经突生长、血管形成、组织修复、炎症、自身免疫、肿瘤生长和转移等(Kjellen L, Lindahl U.Proteoglycans -Structures and interactions AnnuRevBiochem, 1991Vol.60:440-443 ；Bernfield M, Gotte M, Park P ff, et al.Functions ofcell surface heparan sulkfate proteoglycans Annu Rev Biochem, 1999,68:726-729)。硫酸乙酰肝素的酶解是其发挥上述作用的主要因素。酶解后可以释放并激活各种与它结合的活性分子，从而影响各种生理及病理过程。因此，降解硫酸乙酰肝素的酶是至关重要的调节因子，研究该酶(肝素酶III)具有重要的理论意义和应用价值。然而肝素酶III通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得的，肝素黄杆菌生产肝素酶III的同时产生肝素酶1、II和四种软骨素酶(chondroitinase B, C，ABC，AC)，使肝素酶III的分离纯化变得复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。肝素黄杆菌增长速度慢，肝素酶的生产稳定性差，而且产肝素酶需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，限制了肝素酶的应用发展。在这种情况下，利用重组菌株生产肝素酶III成为一条极有前景的途径，然而通常情况下重组肝素酶III极容易形成包涵体，需要复杂的复性过程才能形成活性蛋白。
[0006]本研究小组利用麦芽糖结合蛋白融合技术构建了表达融合肝素酶的基因工程菌株大肠杆菌E.coli ToplO(pMAL-h印C)，实现了肝素酶III 90%以上的高效可溶性表达(CN201010259913.7)。重组肝素酶的表达通常是采用最常用的LB培养基(胰蛋白酶TryptonelOg/L,酵母提取物 Yeast Extract 5g/L, NaCllO g/L, pH7.0)，但经它培养出的重组大肠杆菌E.coli TBl (pMAL-hepA)最高OD6tltl通常在2.0-2.5之间，肝素酶酶活则为1400-2000IU/L发酵液(1IU酶活的定义为30°C每分钟产生I μ mo I不饱和键的反应效力)。此外，LB培养基中的胰蛋白胨和酵母提取物均为成分复杂的组分，每批次产品成分含量变化也比较大，不利于对菌体生长、蛋白表达和分离纯化等实验研究的开展，而且LB培养基的成本也相对较高，因此探究一种既能提高肝素酶III的可溶性表达量又能降低酶生产成本成分相对较简单的培养基具有极其重要的研究价值。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种用于培养微生物表达肝素酶III的培养基。
[0008]本发明所提供的用于培养微生物表达肝素酶III的培养基，是含有5_25g/L酵母提取物，0.5-20g/L葡萄糖，0.5%-2.5% (质量百分比)乙醇的培养基。
[0009]所述培养基中还含有10.0-25.0g/L Na2HPO4.12H20，1.0-5.0g/L KH2PO4,0.1-1.0g/LNaCl，0.5-5.0g/L NH4Cl。
[0010]所述培养基中Na2HPO4.12H20的含量优选为17.1 g/L, KH2PO4的含量优选为3.0g/L，NaCl的含量优选为0.5g/L，NH4Cl的含量优选为1.0g/L。
[0011]所述培养基中，所述酵母提取物的含量为12.5g/L;所述葡萄糖的含量为12.0g/L，所述乙醇的含量为1.0%。
[0012]上述肝素酶III为麦芽糖结合蛋白和肝素酶III的融合蛋白。
[0013]上述微生物为转入可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶III的融合蛋白的重组质粒的工程菌。
[0014]采用本发明的培养基配方培养培养基发酵工程菌，在诱导表达麦芽糖结合蛋白和肝素酶III的融合蛋白过程中，生产的肝素酶酶活可达1776.3IU/L发酵液，表达量可达240mg/L发酵液，比酶活可达7.39IU/mg蛋白。对于肝素酶III的应用，尤其是酶法制备低分子量肝素具有极其显著的经济意义。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0016]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。肝素酶III的酶活测定底物硫酸乙酰肝素购自Sigma公司，其它的化学药品均为一般分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。
[0017]实施例1
[0018] 表达麦芽糖结合蛋白融合肝素酶III的工程菌(构建方法详见CN201010259913.7)，1000mL摇瓶，培养液组成为:酵母提取物5.0g/L ;葡萄糖10.0g/L ；乙醇(质量百分比)1.0%；Na2HP04.12Η20 10.0g/L ；KH2P042.0g/L ；NaC10.2g/L ；NH4Cl1.0g/L ；微量元素(NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2) l(T4mol/L。种子液种龄 24 小时，10%接种，装液量90ml/1000mL，37°C培养30小时。将细胞培养液离心(10，000r/min，8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(12000r/min，30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得1256.2U/L效价的肝素酶III。
[0019]实施例2
[0020]表达麦芽糖结合蛋白融合肝素酶III的工程菌(构建方法详见CN201010259913.7)，1000mL摇瓶，培养液组成为:酵母提取物12.5g/L ;葡萄糖12.0g/L ；乙醇(质量百分比)1.0%；Na2HP04.12Η20 20.0g/L ；KH2P043.0g/L ；NaCl 0.5g/L ；NH4Cl 1.0g/L ;微量元素(NaMo03、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2) l(T4mol/L。种子液种龄 24 小时，10%接种，装液量90ml/1000mL，37°C培养30小时。将细胞培养液离心(10，000r/min，8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(12000r/min，30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得1776.3U/L效价的肝素酶III。
[0021]实施例3
[0022]表达麦芽糖结合蛋白融合肝素酶III的工程菌(构建方法详见CN201010259913.7)，1000mL摇瓶，培养液组成为:酵母提取物17.1 g/L ;葡萄糖15.0g/L ；乙醇(质量百分比)1.0%；Na2HP04.12Η20 20.0g/L ；KH2P043.0g/L ；NaC10.5g/L ；NH4C12.0g/L ;微量元素(NaMo03、CuCl2、FeCl2、CoCl2、MnCl2、CaCl2) l(T4mol/L。种子液种龄 24 小时，10%接种，装液量90ml/1000mL，37°C培养30小时。将细胞培养液离心(10，000r/min，8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(12000r/min，30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得1480.5U/L效价的肝素 酶III。
【权利要求】
1.一种用于培养微生物表达肝素酶III的培养基，是含有5-25g/L酵母提取物，0.5-2(^/1葡萄糖，0.5%-2.5% (质量百分比)乙醇的培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还含有10.0-25.0g/LNa2HP04.12H20,1.0-5.0g/L KH2P04,0.1-1.0g/LNaCl，0.5-5.0g/L NH4C1。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还含有17.1g/LNa2HP04.12Η20，3.0g/L KH2P04,0.5g/LNaCl, 1.0g/L NH4C1。
4.根据权利要求1或2或3所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，所述酵母提取物的含量为12.5g/L ;所述葡萄糖的含量为12.0g/L，所述乙醇的含量为1.0 %。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述微生物为转入可表达所述麦芽糖结合蛋白和肝素酶III的融合蛋白的重组质粒的工程菌。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肝素酶III为麦芽糖结合蛋白和肝素酶III的融合蛋白。
【文档编号】C12R1/19GK104004742SQ201410136867
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】毕鲜荣, 卢元 申请人:北京贝奥康泰医药科技有限公司