一种非诊疗目的禽肿瘤性病毒多重pcr检测方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，提供了一种针对禽肿瘤性病毒的非诊疗目的多重PCR检测方法，可以同时检测REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒，主要通过研究上述四种病毒的特性，分别采用4对特异性引物进行多重PCR反应，通过对反应体系和条件进行优化，筛选出最适反应条件，建立了能够同时检测四种病原的多重RT-PCR方法，用并于临床样品检测判定上述四种病毒是否存在，并且与病理组织切片观察法对照，准确率达95％，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。
【专利说明】—种非诊疗目的禽肿瘤性病毒多重PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，提供了一种非诊疗目的多重PCR检测方法，可以同时检测禽网状内皮组织增生症病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒J亚群及A亚群。
【背景技术】
[0002]禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus，REV)、马立克氏病病毒(Marek，s disease viruses,MDV)禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)均可弓丨起禽类的肿瘤性疾病和免疫抑制性疾病。这三种禽肿瘤性疾病都可以导致不同程度的二重感染、多重感染及继发感染，会减弱鸡群对各种疫苗的免疫应答能力，并加剧一些疾病的临床症状。严重危害着禽业的健康养殖。目前，对这三种肿瘤性疾病临床上并没有有效的药物用于治疗，对RE和AL也没有疫苗可以进行防御。世界各国主要通过抗原/抗体检测，淘汰阳性鸡，净化种群，对MD进行免疫等防治措施来控制这三种禽肿瘤性疾病。
[0003]临床上这三种疾病经常混合感染，增加了其临床快速诊断的难度，而目前常规的诊断方法，例如血清学诊断方法，病毒分离方法，病理组织切片观察法等都存在着敏感度低，耗时较长的 不足，分离病毒方法耗时长且仅适用于实验室诊断；而免疫学检测方法例如ELISA、间接免疫荧光等都需要操作人员具备一定的专业知识，且还需要配备相关设备，并不适用于目前普通养殖场的实际条件；病理组织切片观察法精准但复杂耗时，不适宜临床的快速诊断；多重PCR方法具有敏感性高而且能够一次检测多种病原的优势，更加适用于现在混合感染的临床快速诊断。2002年，韦平等人研发的禽肿瘤性疾病快速鉴别诊断试剂盒就是依据多重PCR原理设计的三重PCR，可以检测REV、MDV、ALV三种病毒，快速简便，但是其未对ALV进行亚型分类且三种病毒的目的条带大小极为接近，不易区分。现有的多重PCR无法满足区分上述多种病毒的要求。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种针对禽肿瘤性病毒的非诊疗目的多重PCR检测方法，可以同时检测REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒，主要通过研究上述四种病毒的特性，分别采用4对特异性引物进行多重PCR反应，通过对反应体系和条件进行优化，筛选出最适反应条件，建立了能够同时检测四种病原的多重RT-PCR方法，用并于临床样品检测判定上述四种病毒是否存在，并且与病理组织切片观察法对照，准确率达95%，整个检测方法敏感性高、特异性好、操作简便、迅速。
[0005]发明人提供的具体技术方案如下:
[0006]利用现有已知REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒特性及其保守基因，发明人获得了 4
对特异性鉴定引物，其序列如下表所示:
[0007]
【权利要求】
1.一种非诊疗目的禽肿瘤性病毒多重PCR检测方法，其特征在于，针对REV、MDV、ALV-J和ALV-A病毒的保守基因采用了 4对特异性引物，其序列如下表所示:
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:多重PCR反应条件中连续40个循环。
【文档编号】C12Q1/70GK103981288SQ201410236110
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月30日 优先权日:2014年5月30日
【发明者】成子强, 徐晨 申请人:山东农业大学