一种检测海德尔堡沙门氏菌靶基因、pcr引物对及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于食品安全检测【技术领域】，提供一种检测海德尔堡沙门氏菌的PCR引物对、特异性靶基因、利用该引物对和靶基因进行检测的方法以及该引物对和特异性靶基因的应用。本发明提供的PCR引物对是根据海德尔堡沙门氏菌特异性靶基因设计而成，该靶基因稳定高、特异性强，经合理优化PCR反应体系，凝胶电泳检测手段，可快速、准确地鉴定出海德尔堡沙门氏菌。本发明检测方法步骤如下(1)提取样品DNA，PCR扩增(2)凝胶电泳检测扩增产物(3)比较电泳后条带，如在788bp位置有条带，则证明样品中含有海德尔堡沙门氏菌。通过实验比较分析，本方法具有单一性强，检测结果可靠，结果判定简单的特点，可广泛应用于食品卫生领域。
【专利说明】-种检测海德尔堡沙门氏菌靶基因、PCR引物对及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测【技术领域】，具体涉及一种检测海德尔堡沙门氏菌的特异 性靶基因、PCR引物对、利用该引物对和靶基因进行检测的方法以及包括引物对和特异性靶 基因的试剂盒和该引物对、靶基因在检测海德尔堡沙门氏菌试剂盒和检测上述沙门氏菌的 应用。
【背景技术】
[0002] 海德尔堡沙门氏菌（Salmonella paratyphi C)是引起人类感染的主要沙门氏菌 血清型之一，此血清型菌株的主要宿主为人类。被感染者会出现不同程度的恶性、呕吐、腹 泻和发热，严重者会出现败血症等。在最近的研究报告中显示，海德尔堡沙门氏菌会通过 某些食物经口腔侵染到健康人体，从而引起以上各方面的症状。如Maria Hoffmann, Yan Luo 等在《Genome announcements》2013 年 1 月 4-12 页发表的题为《Genome sequences of Salmonella enterica serovar Heidelberg isolates isolated in the United States from a multi state outbreak of human Salmonella infections》中所述，海德尔堡沙门氏菌在北 美是主要流行的一种沙门氏菌血清型。同时，国家质量监督检验检疫总局的2002年第25和 26号令中明确规定沙门氏菌为必检项目。目前，海德尔堡沙门氏菌检测主要使用传统的培 养方法，整个检测过程步骤较多，时间较长，一般需要4-6个工作日，而且干扰的因素较多， 检测结果的判定较复杂，给食品检测带来非常不利的影响。
[0003] 目前，随着分子生物学的不断发展尤其是聚合酶链式反应（PCR)的发展，通过分 子技术检测鉴定沙门氏菌血清型变得更加可靠。用于海德尔堡沙门氏菌的PCR检测的靶基 因研究较少且主要是依赖于国外学者的研究，如Hong, Y.，Liu, T等在《BMC microbiology》 2008 年 8 月 178 页发表的题为《Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the 0 and H antigen alleles.》中所述，利用 0 抗原和 H 抗原 的等位基因设计引物进行海德尔堡沙门氏菌的PCR检测。但通过进一步分析，该基因靶点 的特异性很难满足的实际样品的检测，此证明以其作为海德尔堡沙门氏菌的检测靶点很可 能出现假阳性的现象，以上述基因作为靶基因，会造成检测结果不准确。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是通过比较基因组分析获得海德尔堡沙门氏菌的特异性检测靶基 因，从而通过特异性引物对进行PCR扩增、电泳检测该目的基因，解决了检测结果不准确， 检测过程复杂，检测周期长的问题，实现了海德尔堡沙门氏菌高特异性快速检测的目的。
[0005] 本发明提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌的特异性靶基因，SeHAC_2639基因， 碱基序列如SEQ ID NO. 1所示
[0006] 本发明提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌的PCR引物对，该引物对序列为：上 游：SEQ ID N0. 2 ;下游：SEQ ID N0. 3。
[0007] 本发明还提供一种检测海德尔堡沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
[0008] (1)提取样品DNA，PCR扩增；（2)凝胶电泳检测扩增产物（3)比较电泳后条带，如 果在788bp位置有条带，则证明样品中含有海德尔堡沙门氏菌。
[0009] 本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，电泳后788bp位置分离出的DNA片 段大小为788bp的特异性片段，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，PCR检测体系，25ul包含 有：2XMasterl2. 5ul，5uM 引物对 lul，模板取 l-5ul，补 ddH20 至 25ul。 toon] 本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，凝胶电泳采用琼脂糖凝 胶电泳。
[0012] 本发明提供的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，作为优选，以lul模板量加入 25ulPCR反应体系计量，需要海德尔堡沙门氏菌DNA浓度为14pg/ul。此浓度为本发明方法 PCR检测灵敏度。
[0013] 本发明还提供一种用于检测海德尔堡沙门氏菌PCR试剂盒，该试剂盒包括上述的 PCR 引物对，即 pHAml-f、pHAml-r。
[0014] 本发明还提供上述PCR引物对在检测海德尔堡沙门氏菌PCR试剂盒中的应用。
[0015] 本发明还提供上述特异性靶基因，SeHAC_2639基因在检测海德尔堡沙门氏菌中的 应用。
[0016] 本发明具有以下有益效果：采用本发明的检测方法可直接鉴定海德尔堡沙门氏 菌，不需要血清型实验，检测时间缩短在12h以内。并且，由于检测过程无需采用传统检测 方法中必须使用的抗血清，可降低检测成本。本发明通过PCR检测特异性DNA片段，具有单 一性强，检测结果可靠，结果判定简单的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是PCR检测方法对不同菌种特异性评价凝胶电泳结果图
[0018] M.DNA Ladder ;1.海德尔堡沙门氏菌；2.猪霍乱沙门氏菌；3.鼠伤寒沙门氏菌； 4.伤寒沙门氏菌；5.肠炎沙门氏菌；6.甲型副伤寒沙门氏菌；7.乙型副伤寒沙门氏菌； 8.丙型副伤寒沙门氏菌9.汤卜逊沙门氏菌；10.都柏林沙门氏菌；11.鸭沙门氏菌；12.山 夫顿堡沙门氏菌；13.亚利桑那沙门氏菌；14.波斯坦沙门氏菌；15.阿伯丁沙门氏菌； 16.病牛沙门氏菌；17.火鸡沙门氏菌；18.布伦登鲁普沙门氏菌；19.布雷德沙门氏菌； 20.圣保罗沙门氏菌；；21.肯塔基沙门氏菌；22.布洛克利沙门氏菌；23.波纳雷恩沙门氏 菌；24.旺兹沃斯沙门氏菌；25.阿德莱德沙门氏菌；26.达喀尔沙门氏菌；27.伊斯特本沙 门氏菌；28.迈阿密沙门氏菌；29.阿贡纳沙门氏菌；30.巴森海德沙门氏菌；31.蒙特威迪 亚沙门氏菌；32.耶路撒冷沙门氏菌；33.波恩沙门氏菌
[0019] 图2是PCR检测方法对不同模板浓度灵敏度评价凝胶电泳结果图
[0020] M :DL2000 ;模板浓度：1. 14ng/ul、2. 1. 4ng/ul、3. 140pg/ul、4. 14pg/ul、5. 1. 4pg/ ul>6. 140fg/ul>7. 14fg/ul>8. 1. 4fg/ul
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于 现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。
[0022] 实施例1
[0023] PCR检测方法对不同菌种特异性评价
[0024] 1.海德尔堡沙门氏菌血清型特异性基因的筛选
[0025] 在NCBI中获得了海德尔堡沙门氏菌全基因组序列，利用比较基因组的方法通过 Blast比对获得了候选血清型特异性基因，再通过特异性PCR验证，确定SeHAC_2639基因作 为海德尔堡沙门氏菌血清型特异性的检测靶点，基因序列如SEQ ID NO. 1所示.
[0026] 2.引物设计
[0027] 通过Primer5. 0软件设计引物，设置GC%范围在40-60 %，产物大小范围为788bp， 从备选引物对中选择出引物，pHAml-f :序列如SEQ ID NO. 2所示；p HAml-r :序列如SEQ ID NO. 3所示，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0028] 3.DNA模板的制备
[0029] 将包括海德尔堡沙门氏菌等45株沙门氏菌标准菌株和18株非沙门氏菌（如表1) 的各个血清型分别接种到30ml的LB液体培养基中，37°C培养8h。分别取lml各菌菌悬液 于1. 5ml离心管中，11000r/min，离心lmin，弃上清。用500ul灭菌的纯水洗漆菌体沉淀两 次，再用l〇〇ul灭菌纯水溶解沉淀。在沸水浴中煮沸10min，11000r/min，离心lmin，取上清 作为PCR模板。
[0030] 4. PCR反应体系的建立
[0031] 建立PCR检测体系：25ul反应体系包含：2XMasterl2. 5ul，5uM引物对lul，模板 取 5ul，补 ddH20 至 25ul。
[0032] 设计PCR的反应程序：94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 458,30个循环，721：延伸1〇11^11。
[0033] 于PCR仪中按照既定的反应体系和反应程序分别以步骤3中提取的各菌菌株DNA 为模板进行PCR扩增，以做凝胶电泳进行检测。
[0034] 5.凝胶电泳检测
[0035] 将上述进行PCR扩增后的产物、作为Marker的DL2000、ddH20按照既定的顺序分 别取3ul加到1%的琼脂糖凝胶中，用100V电压跑40min后，EB染色后观察结果。
[0036] PCR凝胶检测结果如图1，以包括海德尔堡沙门氏菌在内的33株沙门氏菌DNA作 为模板，PCR扩增后仅有海德尔堡沙门氏菌在788bp出现特异性电泳条带；为更好说明本发 明的特异性，以不同来源的沙门氏菌共45株和18株非沙门氏菌（其中代表分离株，其 它为标准菌株）进行PCR扩增，凝胶电泳得到结果如表1所述。电泳结果在788bp位置出 现扩增条带时，证明为阳性结果，以" + "表示；当该位置没有扩增条带，证明为阴性结果，以 "一"表示；从表1也可以看出，经过该方法PCR扩增，仅海德尔堡沙门氏菌出现阳性反应。 结果很好地说明了本发明提供的方法稳定性高，特异性强，适用范围广，检测结果准确。
[0037] 实施例2
[0038] PCR检测方法对不同模板浓度灵敏度评价
[0039] 海德尔堡沙门氏菌血清型特异性基因的筛选、引物设计步骤如实施例1。
[0040] DNA模板的制备：挑取海德尔堡沙门氏菌单菌落转接到30ml的LB液体培养基中， 37°C过夜培养。以上海生工生物工程技术服务有限公司生产的细菌基因组DNA小量提取试 剂盒，提取海德尔堡沙门氏菌总DNA，经测定，浓度为14ng/ul。用无菌水作10倍梯度稀释， 共稀释7个梯度，作为PCR模板。
[0041] PCR反应体系的建立：建立PCR检测体系：25ul反应体系包含：2XMasterl2. 5ul， 5uM引物对lul，模板取5ul，补ddH20至25ul。设计PCR的反应程序：94°C预变性lOmin， 94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 45s，30 个循环，72°C延伸 lOmin。
[0042] 取上述步骤中7个梯度DNA模板各取lul加入PCR反应体系，于PCR仪上进行反 应扩增。取3ulPCR扩增产物到1%的琼脂糖凝胶中，用100V电压跑40min后，EB染色后观 察结果。
[0043] 电泳结果如图2所示，从第1到第4泳道788bp处均有条带显示，第5及后面泳道 在788bp处便看不到明显条带，第5泳道相应的浓度为1. 4pg/ul。因此，判定PCR检测灵敏 度为14pg/ul，检测样品DNA模板浓度应该彡14pg/u，此浓度可以满足实际检测的需要。
[0044] 可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发 明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这 些改进和变更也属于本发明的保护范围。
[0045] 表1 :特异性评价所用的菌株及检测结果
【权利要求】
1. 一种用于检测海德尔堡沙门氏菌的特异性靶基因，SeHAC_2639基因，其特征在于： 喊基序列如SEQ ID NO. 1。
2. -种用于检测海德尔堡沙门氏菌的PCR引物对，其特征在于：该特异性引物对序列 为：pHAml-f :SEQ ID NO. 2 ;p HAml-r :SEQ ID NO. 3。
3. -种检测海德尔堡沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤： ⑴提取样品DNA，PCR扩增；⑵凝胶电泳检测扩增产物；（3)比较电泳后条带，如果在 788bp位置有条带，则证明样品中含有海德尔堡沙门氏菌。
4. 权利要求3所述的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，其特征在于：电泳后788bp位置 分离出的DNA片段大小为788bp的特异性片段，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
5. 权利要求4所述的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，其特征在于：PCR检测体系，25ul 包含有：2XMasterl2. 5ul，5uM 引物对 lul，模板取 l-5ul，补 ddH20 至 25ul。
6. 权利要求5所述的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，其特征在于：凝胶电泳采用琼脂 糖凝胶电泳。
7. 权利要求5或6所述的检测海德尔堡沙门氏菌的方法，其特征在于：以lul模板量 加入25ulPCR反应体系计量，需要海德尔堡沙门氏菌DNA浓度彡14pg/ul。
8. -种用于检测海德尔堡沙门氏菌PCR试剂盒，其特征在于：试剂盒包括权利要求1 所述的PCR引物对，即pHAml-f、pHAml-r。
9. 权利要求2所述的PCR引物对在检测海德尔堡沙门氏菌PCR试剂盒中的应用。
10. 权利要求1所述的特异性靶基因在检测海德尔堡沙门氏菌中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104046625SQ201410236055
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】别小妹, 翟立公, 陆兆新, 张充, 吕凤霞, 赵海珍 申请人:南京农业大学