一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia.Pastoris)，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，登记入册编号为CGMCC?NO：8924，保藏日期为2014年3月17日。本发明还公开了上述酵母工程菌的构建方法和应用。本发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为27.9U/mL。
【专利说明】一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌及其构建方法和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种表达甲酸脱氢酶的工程菌及其构建 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 甲酸脱氢酶（Formate dehydrogenase, FDH)属于D-2-轻基酸脱氢酶类，广泛存在 于甲醇利用型的细菌及酵母中，根据其4级结构辅基构象和类型分为几种不同类型，其中 最为重要的一类就是NAD+依赖型甲酸脱氢酶（EC1. 2. 1. 2)，它是NAD+/NADH辅酶循环中研 究最多的酶。可以在催化甲酸转化为二氧化碳的同时将NAD+还原为NADH。该类型的甲酸 脱氢酶是由两个相同的亚基所组成，没有包含其他金属离子和辅基，其催化过程中的一个 显著的特点就是来自底物的氢离子直接转移到NAD+的烟碱C4原子上，无需酸碱催化步骤。
[0003] 由于甲酸/甲酸脱氢酶辅酶再生体系具有底物价格低、酶来源广、产物易于从体 系中去除和低浓度的底物不影响其他酶活力等优点，所以使得甲酸脱氢酶体系成为最成功 的辅酶再生系统，目前已应用于手性化合物的工业生产，工业化大规模的生产应用应该是 德国Degussa公司成功利用博伊丁假丝酵母（Candida boidinii)的FDH生产L-叔亮氨酸。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对主流获取甲酸脱氢酶技术上的不足，提供一种 能够将目的酶分泌到菌体细胞外的酵母工程菌，以实现为后续快速有效地分离提纯甲酸脱 氢酶提供粗酶液，带来降低成本、提高菌体利用率和甲酸脱氢酶工业化生产技术革新的应 用价值。
[0005] 本发明还要解决的一个技术问题是提供上述酵母工程菌的构建方法。
[0006] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述酵母工程菌的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] -种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia. Pastoris)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC);地 址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮编：100101 ;登记入册 编号为CGMCC N0. 8924 ;保藏日期为2014年3月17日。
[0009] 上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌是转化有重组突变质粒pPICZ a A-fdh的 分泌型巴斯德毕赤酵母菌，其中，所述的重组突变质粒pPICZ a A-fdh是以醇氧化酶-1基因 为启动子，并含有甲酸脱氢酶基因和Zeocin?抗性基因。
[0010] 上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如 下步骤：
[0011] (1)应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因（如SEQ ID No :1所示）；
[0012] (2)应用常规重组质粒构建方法构建重组质粒pPICZ a A-fdh ;
[0013] (3)将重组质粒pPICZ a A-fdh用Sal I线性化后，电击转化入宿主菌巴斯德毕赤 酵母中，即构成重组菌；
[0014] (4)将上述重组菌经过抗生素筛选和甲醇诱导表达后，即得出能够外源表达甲酸 脱氢酶的酵母工程菌。
[0015] 步骤（1)中，使用引物设计软件设计引物并应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因， 引物设计软件采用Stratagene公司的在线引物设计软件QuikChangc? Primer Design Program。
[0016] 步骤⑵中，所述的重组质粒pPICZa A-fdh是将甲酸脱氢酶基因插入到 质粒pPICZ a A中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Mulit-Copy PichiaExpression Kit 操作手册。
[0017] 步骤（3)中，将重组质粒pPICZ a A-fdh用Sal I内切酶线性化后电击转化入宿主 菌巴斯德毕赤酵母之前，先将其转化到大肠杆菌中进行扩增。
[0018] 上述外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌在制备甲酸脱氢酶中的应用。
[0019] 具体的应用方法为，将外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌CGMCC N0. 8924在BMGY 培养基中培养至〇D6(?为2?6,离心上清后用BMMY重悬至0D_为1. 0用以诱导表达，维持 甲醇浓度为lv/v%，将所得的BMMY菌液诱导产酶96小时。
[0020] 有益效果：本发明所得到的甲酸脱氢酶外源表达酵母工程菌，能够外源表达甲酸 脱氢酶到细胞外，使得提纯甲酸脱氢酶的技术要求变得更简便，与传统的破碎细胞后再提 纯甲酸脱氢酶工艺条件更加的简便。本发明的酵母工程菌经甲醇诱导后，测的粗酶活为 27.9U/mL。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1重组质粒pPICZ a A-fdh的结构示意图。
[0022] 图2诱导表达后的酶活示意图。
【具体实施方式】
[0023] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0024] 实施例1 :目的基因的获得。
[0025] 根据NCBI上的博伊丁假丝酵母的FDH基因设计引物用于获得甲酸脱氢酶基因， 引物设计软件采用Stratagene公司的在线引物设计软件QuikChange :、S: primer Design Program。选用EcoRI和Notl酶切位点，引物设计如下（下划线为酶切位点）：
[0026] c. boipp. f5, - GAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC- 3'
[0027] c. boitt. r5, - GCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTT- 3'
[0028] 表1PCR反应参数
[0029]
【权利要求】
1. 一种外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia. Pastoris)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为 CGMCC NO. 8924,保藏日期为2014年3月17日。
2. 根据权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌，其特征在于，它是转化 有重组突变质粒pPICZ a A-fdh的分泌型巴斯德毕赤酵母菌，其中，所述的重组突变质粒 pPICZ a A-fdh是以醇氧化酶-1基因为启动子，并含有甲酸脱氢酶基因和Zeocin?抗性基 因。
3. 权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在于，该 方法包括如下步骤： (1)应用PCR方法获得甲酸脱氢酶基因； ⑵构建重组质粒pPICZ a A-fdh ; (3) 将重组质粒pPICZ a A-fdh用Sal I线性化后，电击转化入宿主菌巴斯德毕赤酵母 中，即构成重组菌； (4) 将上述重组菌经过抗生素筛选和甲醇诱导表达后，即得出能够外源表达甲酸脱氢 酶的酵母工程菌。
4. 根据权利要求3所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在 于，步骤（2)中，所述的重组质粒pPICZ a A-fdh是将甲酸脱氢酶基因插入到质粒pPICZ α A 中形成的重组质粒。
5. 根据权利要求3所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌的构建方法，其特征在 于，步骤⑶中，将重组质粒pPICZ a A-fdh用Sal I内切酶线性化后电击转化入宿主菌巴 斯德毕赤酵母之前，先将其转化到大肠杆菌中进行扩增。
6. 权利要求1所述的外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌在制备甲酸脱氢酶中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将外源表达甲酸脱氢酶的酵母工程菌 CGMCC NO. 8924在BMGY培养基中培养至0D6(i(i为2?6,离心上清后用BMMY重悬至0D6QQ为 1. 〇用以诱导表达，维持甲醇浓度为lv/v%，将所得的BMMY菌液诱导产酶96小时。
【文档编号】C12N15/81GK104087522SQ201410306082
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】李鑫, 孙秀程, 欧阳嘉, 姜婷, 勇强, 余世袁, 郑兆娟, 徐勇, 陈牧, 连之娜 申请人:南京林业大学