一种亮氨酸脱氢酶和编码该脱氢酶的基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明还公开了编码该亮氨酸脱氢酶的基因。本发明提供了与目前已知的亮氨酸脱氢酶来源不同的一种新型脱氢酶。本发明以Bacillus?coagulans基因组为基础，克隆其亮氨酸脱氢酶基因ldh，该核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1，编码亮氨酸脱氢酶。亮氨酸脱氢酶在催化羰基不对称还原制备光学纯氨基酸及其衍生物具有非常大的优势。同时，本发明还提供了制备、分离、纯化具有耐热型亮氨酸脱氢酶活性的方法。
【专利说明】一种亮氨酸脱氢酶和编码该脱氢酶的基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程和微生物【技术领域】，具体涉及一种亮氨酸脱氢酶和编码该脱氢酶的基因。
【背景技术】
[0002]亮氛酸脱氧酶(LeucineDehydrogenase, LDH, ECl.4.1.9)是一种 NAD+-依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支链L-氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物。该酶在芽孢杆菌中有较高表达水平，主要参与支链L-氨基酸的体内代谢。除此，亮氨酸脱氢酶可用于支链脂肪酸及其酮酸类似物的测定。亮氨酸脱氢酶的工业化应用主要是辅酶NADH的酶耦联法再生系统和酶膜反应器中。
[0003]目前高活性亮氨酸脱氢酶菌株已被筛选出来，包括常温菌株(Bacillussphaericus, Bacillus cereus)和嗜热菌株(Clostridium thermoaceticum, Bacillusstearothermophlius, Bacillus spec., Bacillus sphaericus)等。这些亮氨酸脱氢酶都具有比较高的热稳定性，从而为该酶的分离纯化和工业上的连续反应过程提供便利。不同来源的亮氨酸脱氢酶在分子结构、酶学性质和功能上都有不同。嗜热芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是兼性厌氧微生物，具有营养要求低，抗逆性强、易储存，食用安全性好等独特性质，是一种近年来受到广泛关注的潜在木糖高效利用工业乳酸菌。该菌可通过同型乳酸发酵途径转化葡萄糖和木糖生产高光学纯度的L-乳酸，且发酵过程易于控制、最适发酵温度高(50~60°C)。到目前为止，还没有关于凝结芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因的报道，鉴于亮氨酸脱氢酶在催化制备L-亮氨酸、叔亮氨酸等方面的优势，筛选高活性亮氨酸脱氢酶菌株对于工业化生产具有重要 的意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种亮氨酸脱氢酶，有利于进一步研究亮氨酸脱氢酶的结构和功能之间的联系。通过蛋白质工程定向改造，为制备适合工业化生产的亮氨酸脱氢酶提供理论支持。
[0005]本发明还要解决的技术问题是提供编码上述亮氨酸脱氢酶的基因。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其碱基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]一种重组质粒，它含有权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶基因。
[0010]一种重组菌，它包含权利3所述的重组质粒。
[0011]构建上述重组菌的方法，将亮氨酸脱氢酶基因SEQ ID N0.1连接到表达质粒载体pETDuet-Ι上，将含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-ldh转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌 E.coli BL21-pETDuet-l_ldh。
[0012]上述重组菌在制备亮氨酸脱氢酶中的应用。[0013]具体应用方法为，在营养培养基中培养重组菌，收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。
[0014]优选的方法为，将重组菌E.coli BL21-pETDuet-1-ldh，于 5mL 含 100 μ g/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养37°C过夜；按lv/v%的接种量吸取培养液转接到新的含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，待OD6tltol达到0.6~1.0后，加入的IPTG至终浓度为0.1~ImM，于低温下进行诱导表达，培养6~12h小时；离心收集菌液，倒掉上清培养基，用PBS等体积洗涤三次，加入Binding Buffer使得重悬菌液OD6tltlnm达到20，加入终浓度为10~15v/v%的甘油,0.1~ImM的苯甲基磺酰氟,混匀；用超声破碎仪破碎，破碎后，1000rpm离心30min取上清粗酶液；粗酶液用0.22 μ m膜过滤除去杂质，再采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化。
[0015]最优选的方法为:将重组菌E.coli BL21-pETDuet-1-ldh,于 5mL 含 100 μ g/mL 氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养37°C过夜；按lv/v%的接种量吸取培养液转接到新的含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，约2~3小时，待OD6tltlnm达到
0.8后，加入的IPTG至终浓度为ImM，于20°C下进行诱导表达，培养1h小时；收集菌液，6000rpm, 1min,倒掉上清培养基,用PBS等体积洗漆三次,加入BindingBuffer使得重悬菌液OD6tltlnm达到20，加入终浓度为1(^八％的甘油，ImM的苯甲基磺酰氟，混匀；用超声破碎仪破碎，超声波破碎条件:工作时间设为20min，每次工作5s，休息5s，功率设为200w，破碎后，1000rpm离心30min取上清粗酶液；粗酶液用0.22 μ m膜过滤除去杂质,再采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化。
[0016]按照上述方法制备得到的亮氨酸脱氢酶，在25°C，pH9.0条件下，纯酶液的酶活为1289.39IU，比酶活为865.36U/mg ;在50°C，pH9.0条件下，纯酶液的酶活为1993.57IU，比酶活为 1337.97U/mg。
[0017]本发明是以凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)基因组为模板,设计特异性引物，扩增出亮氨酸脱氢酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。利用DNA重组技术将本发明得到的亮氨酸脱氢酶基因在原核细胞中进行诱导表达，获得的重组亮氨酸脱氢酶共367个氨基酸，分子量为40~42kDa。
[0018]通过Blast软件在线比较分析，发现来自于凝结芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列与其它微生物的已知亮氨酸脱氢酶基因的同源性差异较大，与Geobacillusthermoglucosidasius、Bacillus subtilis、Thermoactinomyces intermedius、Bacilluscereus 的一致性分别为 75%、73%、69%、68%。
[0019]本发明中，术语“亮氨酸脱氢酶”还包括能编码具有与亮氨酸脱氢酶相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1的突变形式，所述突变类型包括:确实、无义、插入、错义。
[0020]本发明实例中，所述的基因全长1104bp。将该基因连接在表达载体pETDuet-Ι上，构建重组质粒pETDuet-1-ldh，随后将该重组质粒转化到感受态细胞E.coli BL21 (DE3)中，将含有重组质粒pETDuet-1-ldh的大肠杆菌细胞转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基上进行培养。待OD6ticinmS 0.8时，加入终浓度为ImM的IPTG诱导目的基因的表达，诱导结束后采用超声波破碎细胞，获得具有活性的亮氨酸脱氢酶。用紫外分光光度计分别测定了粗酶液和空白对照含有质粒pETDuet-Ι大肠杆菌表达产物的酶活力。ImL反应体系下:pH9.0的NH4CVNH3.Η20缓冲液，含1mM α -酮异己酸钠，5mM NADH加入10 μ L的酶液于25°C下下检测到340nm处吸光值的降低，而空白对照检测不到酶活力。证明诱导表达出的亮氨酸脱
氢酶具有活性。
[0021]粗酶液经镍柱亲和层析时,先用100% Binding buffer洗去杂蛋白后，再用40%Elut1n Buffer的洗脱液将目的蛋白洗脱下来。用紫外分光光度计分别测定了已纯化的酶液，在50°C，pH9.0条件下，纯酶液的酶活为1993.57IU，比酶活为1337.97U/mg。
[0022]有益效果:生产L-亮氨酸和L-叔亮氨酸的方法主要有化学合成法和酶催化法。化学合成法工艺复杂，污染大；而酶法具有反应条件温和，成本低，转化能力强，产物相对单一等优点。亮氨酸脱氢酶在催化制备氨基酸方面有非常大的优势。本发明提供一种来自于Bacillus coagulans的売氣酸脱氧酶，运用基因工程实现其闻效表达，提闻了売氣酸脱氧酶的生产效率，降低生产成本，有利于进一步研究亮氨酸脱氢酶的结构和功能之间的联系。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1是含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-ldh结构图。
[0024]图2是含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-ldh双酶切单酶切验证电泳结果。其中，M:Marker DL5, 000 ;1:重组质粒 pETDuet-1-ldh ;2:质粒 ppETDuet-Ι 双酶切；3:重组质粒pETDuet-1-ldh双酶切的两段基因；4:重组质粒pETDuet-1-ldh单酶切的一段基因。
[0025]图3是诱导表达后粗酶液和纯酶液的SDS-PAGE电泳结果图。其中M = ProteinMarker ;1:40 %洗脱缓冲液 洗脱得到的纯酶；2:重组菌的诱导表达的粗酶；3:含有pETDuet-Ι的大肠杆菌的诱导表达产物。
【具体实施方式】
[0026]本发明提供了编码亮氨酸脱氢酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Bacillus coagulans中分离得到的，具有SElID N0.1的核苷酸序列，它编码367个氨基酸的多肽，推测分子量为40~42kDa.[0027]本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的核苷酸分子，以及包含重组质粒的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组质粒和宿主细胞的方法，以及用重组工程生产亮氨酸脱氢酶的方法。
[0028]本发明进一步地提供了一种亮氨酸脱氢酶，具有SEQ ID N0.2氨基酸序列，或至少70 %相似，较佳地至少80 %，更佳地，至少具有90 %，95 %，99 %的相同。
[0029]在本发明中，“亮氨酸脱氢酶”是指具有亮氨酸脱氢酶活性的SEQ ID N0.2序列的多肽。该术语还包括SEQ ID N0.2序列的变异体，包括(但不限于)若干个氨基酸的缺失，插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，也可以使不影响序列的修饰形式上的差异。
[0030]本发明的亮氨酸脱氢酶酶基因全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法，重组法，或人工合成法获得。
[0031 ] 本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。
[0032]重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括:氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。[0033]本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核细胞如大肠杆菌，乳酸乳球菌等。常用的真核细胞如酵母细胞，或各种动植物细胞。
[0034]下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》，或按照制造厂商所建议的条件。
[0035]实施例1:含有亮氨酸脱氢酶基因序列的重组菌的构建。
[0036]利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库，推定、获得来自Bacilluscoagulans的亮氨酸脱氢酶基因，具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列。并将其连接到表达载体pETDuet-Ι质粒上，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中，经过蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并进行酶切验证，确定重组质粒pETDuet-1-ldh(图1)构建成功。随后将重组质粒pETDuet-1-ldh转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，以抗生素标记法筛选(本例中为氨苄青霉素)阳性的重组高效表达菌BL21-pETDuet-1-ldh。重组质粒pETDuet-1-ldh酶切电泳验证电泳结果(图2)表明，单克隆菌落含有目的基因片段，可用于后续的亮氨酸脱氢酶蛋白的诱导表达。
[0037]实施例2:重组亮氨酸脱氢酶的表达和纯化。
[0038]挑取单菌落的工程菌E.coliBL21-pETDuet-1-ldh,于5mL含100 μ g/mL氨节青霉素的LB液体培养基中振荡培养37°C过夜。按I %的接种量吸取培养液转接到新的LB液体培养基(含100 μ g/mL氨苄青霉素)中进行培养，约2~3小时，待OD6tltol达到0.8后，加入的IPTG至终浓度为ImM，于20°C下进行诱导表达，培养1h小时。收集菌液，6000rpm，1min,倒掉上清培养基,用PBS等体积洗漆三次,加入适量的Binding Buffer使得重悬菌液OD6tltol大约为20左右，加入终浓度为10% (v/v)甘油，ImM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，混匀。用超声破碎仪破碎，超声波破碎条件:工作时间设为20min，每次工作5s，休息5s，功率设为200w，破碎后，1000rpm离心30min取上清粗酶液。将收集到的蛋白(SOyL)与I X SDS-PAGE样品缓冲液,按1:1体积比与沸水中煮沸5min失活，12000rpm离心Imin,上清加入12% SDS-PAGE胶中进行电泳验证。用含有质粒pETDuet-Ι的E.coli BL21 (DE3)诱导表达出的蛋白作为空白对照，验证结果如图3所示。对获得的含有亮氨酸脱氢酶的粗酶液用0.22 μ m膜过滤除去杂质，采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化，上样前预先5倍柱体积的缓冲液平衡亲和柱，上样后先以100 %的Binding Buffer洗脱杂蛋白，再用40% Elut1n Buffer的洗脱液将目的蛋白洗脱下来，以8mL为单位分管收集合并。目的蛋白保存于4°C，并进行SDS-PAGE电泳检测纯化效果。在40~42kDa处的蛋白质条带即为亮氨酸脱氢酶，如图3所示。
[0039]实施例3:重组亮氨酸脱氢酶酶学性质的测定。
[0040]将纯化后的亮氨酸脱氢酶分别测定其最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、底物特异性和动力学研究等。
[0041]亮氨酸脱氢酶酶活测定，按照表1中所示的反应体系加入各组分，对照采用含有质粒pETDuet-Ι大肠杆菌表达产物。基本原理是鉴于NADH在340nm处有最大吸收峰，通过光吸收峰值的改变定量测定酶的含量。比色皿中依次加入NH4CVNH3 -H2O缓冲液，α -酮异己酸钠和NADH溶液并混匀，置于分光光度计样品槽中，检测原始NADH吸光值，待读数稳定后马上加入10 μ L的稀释适当倍数酶液，开始光度计读数，每3s测定一次吸光值，反应结束后得到Zl A34(lnm/min值。酶活单位采用国际单位IU,即每分钟氧化I μ mo I的NADH所用的酶量为I个酶活力单位。
[0042]表1亮氨酸脱氢酶活性检测
[0043]
【权利要求】
1.一种亮氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其碱基序列如SEQID N0.1所示。
3.—种重组质粒，其特征在于，它含有权利要求2所述的亮氨酸脱氢酶基因。
4.一种重组菌，其特征在于，它包含权利3所述的重组质粒。
5.构建权利要求4所述的重组菌的方法，其特征在于，将亮氨酸脱氢酶基因SEQID N0.1连接到表达质粒载体pETDuet-Ι上，将含有亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pETDuet-1-ldh 转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中，得到重组菌 Ε.coli BL21-pETDuet-l_ldh。
6.权利要求4所述的重组菌在制备亮氨酸脱氢酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在营养培养基中培养权利要求4所述的重组菌，收集具有亮氨酸脱氢酶活性的多肽。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将重组菌E.coli BL21-pETDuet-1-ldh，于5mL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中振荡培养37°C过夜；按lv/v%的接种量吸取培养液转接到新的含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，待OD6tltol达到0.6~1.0后，加入的IPTG至终浓度为0.1~ImM，于低温下进行诱导表达，培养6~12h小时；离心收集菌液，倒掉上清培养基，用PBS等体积洗涤三次，加入Binding Buffer使得重悬菌液OD6tltol达到20，加入终浓度为10~15V/V%的甘油，0.1~ImM的苯甲基磺酰氟，混匀；用超声破碎仪破碎，破碎后，1000rpm离心30min取上清粗酶液；粗酶液用0.22 μ m膜过滤除去杂质，再采用亲和介质填充层析柱镍柱对重组蛋白进行纯化。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，制备得到的亮氨酸脱氢酶，在25°C，pH9.0条件下，纯酶液的酶活为1289.39IU，比酶活为865.36U/mg ;在50°C，pH9.0条件下，纯酶液的酶活为1993.57IU，比酶活为1337.97U/mg。
【文档编号】C12N1/21GK104031892SQ201410306060
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】李鑫, 姜婷, 欧阳嘉, 勇强, 余世袁, 徐勇, 郑兆娟, 朱均均, 孙秀程, 莫逸仙 申请人:南京林业大学