一种青霉素酰化酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种青霉素酰化酶的制备方法，该方法为微生物发酵法，采用大肠杆菌逐级制备一级种子和二级种子，然后使用二级种子在发酵培养基中进行发酵制备得到青霉素酰化酶，制备得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上，显著提高了生产效率。
【专利说明】一种青霉素酰化酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种微生物发酵制备青霉素酰化酶的方法。
【背景技术】
[0002] 青霉素酰化酶（penicillin acylase，简称PA)又称为青霉素酰基转移酶，是 β_内酰胺类抗生素工业生产中较为关键的酶，用量很大。
[0003] 青霉素酰化酶既是胞内酶又是胞外酶，可以通过产酶微生物的营养控制代谢及基 因型改变，进行大规模的生产。青霉素酰化酶主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞 外酶获得，报道最多的是关于埃希氏菌属大肠杆菌发酵生产青霉素 G酰化酶。近年来的研 究倾向于3个方面：利用物理或化学诱变方法、基因工程方法对产青霉素酰化酶的菌株进 行改造，突变菌种的分离以及酶在不同的产酶宿主细胞中的克隆和表达。如利用紫外光诱 变巨大芽孢杆菌可以获得酶产量增加4倍的突变菌株，利用重组DNA技术将编码青霉素酰 化酶的基因导入宿主细胞中，构建了高产分泌型工程菌，但酶的应用性能还有待提升。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种青霉素酰化酶的制备方法，该方法制备得到的青霉素酰 化酶的活性在40000U/L以上。
[0005] 为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。
[0006] -种青霉素酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
[0007] a.取大肠杆菌，在35-40°C条件下制备一级种子和二级种子，所用种子培养基含 有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl ;
[0008] b.将步骤a制备的二级种子接种至发酵培养基中，在35_40°C培养15_30h，得到发 酵液，所述发酵培养基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；
[0009] c.将步骤b制备的发酵液进行离心，弃去上清液，收集下层的菌体浓缩液，即得到 青霉素酰化酶的粗品溶液；
[0010] d.将步骤c所得青霉素酰化酶的粗品溶液进行均质，絮凝，超滤浓缩，沉淀除去杂 蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
[0011] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，在37-38°C条件下制备一级种子和 二级种子。
[0012] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，种子培养基含蛋白胨5-10重量份， 酵母浸骨2-5重量份，NaCl 5-10重量份，去尚子水1000重量份。
[0013] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基 体积的3-9%。
[0014] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基 体积的6%。
[0015] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的温度为37_38°C。
[0016] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的时间为26h。
[0017] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，发酵培养基为每150mL微量元素水 溶液中加入甘油10_20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaC15-10g。
[0018] 上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，所述微量元素水溶液的配比为：每 升去离子水中含有FeCl 3.6 H20 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2.6H20 0.24g，NaMo04.2H200.24g， CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，Η3Β031· 0g，MgS040. 74g。
[0019] 本发明所述方法，步骤a中制备一级种子和二级种子选择在35_40°C条件下进行， 符合大肠杆菌的生长特性，在此范围内，菌体的密度会随着温度的升高而升高，在37-38°C 是增长的速度最快，随后增长趋缓。
[0020] 步骤b中选择的接种比例为3-9%，在此比例范围内发酵产量与接种量的比较高， 尤其是当二级种子的接种量为发酵培养基体积的6%时，产出接种比最高。
[0021] 步骤b中，二级种子在35-40°C条件下培养种子发酵速度较快，在37-38°C条件下 发酵速度最快，发酵时间在15_30h内，时间太短发酵不充分，时间太长会产生菌体自溶，发 酵时间在26h时发酵效果最好。
[0022] 步骤a中，种子培养基的组成中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提 供碳源，而NaCl提供无机盐。这种培养基适于培养细菌。
[0023] 同样的，步骤b中发酵培养基的组分中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨 和甘油主要提供碳源，而NaCl提供无机盐。选取这种培养基有利于菌体生长、代谢产酶。
[0024] 步骤b中微量元素水溶液的加入是为了补充细菌生长所需的无机盐。
[0025] 本发明所述青霉素酰化酶的制备方法，选择合适的培养基及培养条件，能够制备 得到活性在40000U/L以上的青霉素酰化酶，提高了发酵产量，明显提高了生产效率。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
[0027] 实施例1
[0028] 种子培养基的制备：蛋白胨5g，酵母粉2g，NaC15g，去离子水1000g，混合均勻，用 Imol/LNaOH调节pH值至6. 5,121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0029] 微量元素水溶液的配置：去离子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均匀，备用。
[0030] 发酵培养基的配置：甘油l〇g，酵母粉20g，蛋白胨10g，NaCl 5g，150mL微量元素水 溶液，混合均匀，用lmol/L的盐酸调节pH值至6. 5，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0031] 将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在35°C培养6h而后按0. 3%的接种量接种至种 子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发 酵培养基体积的3%接种量接入发酵培养基中，在35°C培养15h，得到发酵液，即微生物发 酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液（即含菌体部分），即为青霉素 酰化酶粗品溶液，活性为45000u/l。
[0032] 将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进 行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
[0033] 根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0034] 实施例2
[0035] 种子培养基的制备：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，去离子水1000g，混合均 勻，用lmol/L NaOH调节pH值至7. 0,121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0036] 微量元素水溶液的配置：去离子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均匀，备用。
[0037] 发酵培养基的配置：甘油20g，酵母粉30g，蛋白胨20g，NaCl 10g，150mL微量元素 水溶液，混合均匀，用lmol/L盐酸调节pH值至6.5,121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0038] 将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在40°C培养12h而后按0. 3%的接种量接种至 种子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按 发酵培养基体积的9%接种量接入发酵培养基中，在40°C培养30h，得到发酵液，即微生物 发酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液（即含菌体部分），即为青霉 素酰化酶粗品溶液，活性为53000U/1。
[0039] 将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进 行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
[0040] 根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0041] 实施例3
[0042] 种子培养基的制备：蛋白胨8g，酵母浸膏3g，NaC17g，去离子水1000g，混合均勻， 用lmol/L盐酸调节pH值至7. 0,121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0043] 微量元素水溶液的配置：去离子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均匀，备用。
[0044] 发酵培养基的配置：甘油15g，酵母粉25g，蛋白胨15g，NaCl 8g，150mL微量元素水 溶液，混合均匀，用Imol/LNaOH调节pH值至7.0，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0045] 将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在37°C培养8h而后按0. 3%的接种量接种至种 子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发 酵培养基体积的6%接种量接入发酵培养基中，在37°C培养26h，得到发酵液，即微生物发 酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液（即含菌体部分），即为青霉素 酰化酶粗品溶液，活性为61000u/l。
[0046] 将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进 行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
[0047] 根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0048] 实施例4
[0049] 种子培养基的制备：蛋白胨6g，酵母浸膏4g，NaC16g，去离子水1000g，混合均勻， 用Imol/LNaOH调节pH值至6. 5,121 °C高压蒸汽灭菌30min。
[0050] 微量元素水溶液的配置：去离子水1. 0L，加入FeCl3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24 g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g，混合均匀，备用。
【权利要求】
1. 一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a. 取大肠杆菌，在35-40°C条件下制备一级种子和二级种子，所用种子培养基含有蛋 白胨，酵母浸膏，NaCl ; b. 将步骤a制备的二级种子接种至发酵培养基中，在35-40°C培养15-30h，得到发酵 液，所述发酵培养基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液； c. 将步骤b制备的发酵液进行离心，弃去上清液，收集下层的菌体浓缩液，即得到青霉 素酰化酶的粗品溶液； d. 将步骤c所得青霉素酰化酶的粗品溶液进行均质，絮凝，超滤浓缩，沉淀除去杂蛋 白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
2. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤a中， 在37-38°C条件下制备一级种子和二级种子。
3. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤a中， 种子培养基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaC15-10重量份，去离子水1000 重量份。
4. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 二级种子的接种量为发酵培养基体积的3-9%。
5. 根据权利要求4所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 二级种子的接种量为发酵培养基体积的6%。
6. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 培养的温度为37-38°C。
7. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 培养的时间为26h。
8. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 发酵培养基为每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、 NaCl 5-10g〇
9. 根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中， 所述微量元素水溶液的配比为：每升去离子水中含有FeCl 3 · 6 H20 3. 24g，ZnCl20. 22g， CoCl2 · 6H20 0· 24g，NaMo04 · 2Η200· 24g，CaCl2 · 2H20 0· 12g，CuS04 · 5H20 0· 20g，H3B03L 0g， MgS040 . 74g〇
【文档编号】C12N9/10GK104087565SQ201410365989
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】李红飞, 刘健, 陈英新, 徐永龙, 梅玉龙, 郝金恒, 李银, 袁国强 申请人:石药集团中诺药业（石家庄）有限公司