检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物，其特征在于：所述上游引物序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物序列如SEQIDNO.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQIDNO.3所示序列。使用本发明试剂盒对太平洋鳕神经坏死病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测线性范围广等优点。本发明试剂盒可应用于太平洋鳕人工养殖中，从选择不携带病毒的亲鱼开始选育，并对精子、卵子、受精卵及仔稚鱼进行实时监测，以确保亲鱼、精子、卵子、受精卵和仔稚鱼体内携带的病毒量处于低水平，避免因病毒爆发而导致鱼苗大量死亡，从而克服了太平洋鳕人工繁育的瓶颈。
【专利说明】检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测鱼类病毒用试剂盒，尤其是一种检测太平洋鳕亲鱼与仔稚鱼神经坏死病毒用试剂盒。
【背景技术】
[0002]太平洋鳕是我国北方重要的海水经济鱼类，目前由于过度捕捞以及环境的影响，中国近海水域的太平洋鳕数量不断减少。为此，人们对太平洋鳕进行了人工养殖，但是其在仔稚鱼期就会出现短期大量死亡现象。虽然已有研究表明，鱼类发育初期主要依赖于非特异免疫(包括母源抗体)的保护，若特异免疫系统发育较晚，仔稚鱼的免疫力可能在一段时间内相对薄弱，不能满足鱼体的需求，导致了鱼体自身携带病毒的爆发，以至于鱼苗大量死亡。但是，迄今为止，对于太平洋鳕还没有关于自身携带病毒以及检测试剂盒的相关报道，鱼苗大量死亡成为制约太平洋鳕人工育苗的瓶颈。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种利用绝对荧光定量PCR (FQ-PCR)方法检测太平洋鳕亲鱼与仔稚鱼神经坏死病毒用试剂盒。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物以及神经坏死病毒基因的质粒标准品，其特征在于:所述上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID N0.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID N0.3所不序列。
[0005]本发明发现了制约太平洋鳕人工繁育的关键病原(即神经坏死病毒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)，并建立了检测该病毒的试剂盒。使用本发明试剂盒对太平洋鳕神经坏死病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、检测线性范围广等优点。本发明试剂盒可应用于太平洋鳕人工养殖中，从选择不携带病毒的亲鱼开始选育，并对精子、卵子、受精卵及仔稚鱼进行实时监测，以确保亲鱼、精子、卵子、受精卵和仔稚鱼体内携带的病毒量处于低水平，避免因病毒爆发而导致鱼苗大量死亡，从而克服了太平洋鳕人工繁育的瓶颈。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1本发明实施例所用特异性引物扩增的熔解曲线。
[0007]图2本发明实施例病毒基因PCR产物重组质粒1.2%的琼脂糖凝胶电泳图。
[0008]图3是本发明实施例扩增质粒标准品的定量限和灵敏度检测结果示意图。
[0009]图4本发明实施例根据标准品(12 X、13X、14 X、15 XUO6X)荧光定量PCR结果建立的标准曲线图。
[0010]图5本发明实施例太平洋鳕组织PCR产物1.2%的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0011]1.太平洋鳕神经坏死病毒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]2.建立了检测太平洋鳕神经坏死病毒的绝对荧光定量PCR试剂盒，有上游引物、下游引物、qPCR SuperMix及ddH20，所述上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID N0.2所示,所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID N0.3所示序列。
[0013]20 μ I反应体系如下:
模板I μ I
上游引物I μ I
下游引物I μ I
含SYBR的聚合酶链式反应液10 μ I
ddH207 μ I 反应程序:
50°C 2min ；95°C 1min ；
95°C 30s, 60°C lmin，40 个循环。
[0014]本发明所用特异性引物扩增的熔解曲线如图1所示，横坐标为退火温度，纵坐标为荧光值。
[0015]神经坏死病毒基因的质粒标准品按如下方法获得:
取具有神经坏死病毒症状(幼鱼游泳状态异常，呈螺旋或转圈游泳，且经常漂浮在水面)的太平洋鳕幼鱼头部提取总RNA，利用反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA，以本发明试剂盒的引物进行绝对荧光定量PCR，获得病毒基因PCR产物；将所得到病毒基因PCR产物与pMD18-T载体(由大连宝生物公司提供)连接获得该基因重组的载体，转化大肠杆菌，取IuL菌液经载体特异引物M13 (由大连宝生物公司提供)筛选阳性克隆菌株，用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，表明我们获得了含有目的基因的克隆菌株。通过质粒提取试剂盒(由上海生物工程有限公司提供)获得含有该病毒基因的质粒，作为标准品母液。
[0016]以对成年太平洋鳕(未知样品)的具体检测步骤如下:
1.建立标准曲线
将标准品母液倍倍稀释(11X、102X、103X、104X、105X )作为绝对定量的质粒标准品。标准品浓度是在微量核酸浓度测定仪中测定，1μ I的质粒标准品含有病毒的拷贝数通过如下公式获得:基因拷贝数=(I * 6.022xl023) / (length * IxlO9 * 650)，length 指插入片段的长度。
[0017]用本发明试剂盒对不同浓度的标准品进行绝对荧光定量PCR反应，扩增质粒标准品的定量限和灵敏度检测结果如图3所示。根据标准(102X、103X、104X、105X、106X)荧光定量PCR结果建立的标准曲线如图4所示，横坐标为拷贝数的Ig值，纵坐标为Ct值。
[0018]2.RNA 提取:
取成年太平洋鳕的脑、头肾组织，9日龄幼鱼及17日龄幼鱼组织为样品，样品50-100mg,加入1000 μ I trizol,用研磨件将组织彻底研磨,室温孵育15min,使样品裂解至透明，按现有技术的方法提取RNA。
[0019]3.利用反转录试剂盒进行反转录反应合成cDNA。
[0020]4.以所获得的太平洋鳕cDNA为模板，以本发明的试剂盒采用ABI系列荧光定量PCR仪(ABI7500)进行荧光定量PCR反应；
对所得成鱼脑和头肾组织荧光定量PCR产物用于1.2%的琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，表明引物效率高，荧光定量程序可靠。
[0021]5.用测得的未知样品的Ct值，计算得出未知样品的拷贝数的对数值，从而计算得出未知样品的拷贝数。如
成鱼脑组织Ct值29.04，对数值1.85，拷贝数70.94 ；
成鱼头肾组织Ct值30.58，对数值0.69，拷贝数4.93。
[0022]9日龄幼鱼Ct值30.82，对数值1.32，拷贝数20.67 ；
17日龄幼鱼Ct值27.31，对数值2.37，拷贝数235.49。
[0023]照上述方法检测亲鱼的性腺，筛选不携带病毒的亲鱼作为育种的亲本。
[0024]按照上述方法检测卵、精液、受精卵中病毒水平，对出现阳性信号的受精卵需进行消毒处理，处理后重新进行病毒检测，直至检测结果符合要求，进行下一步育苗。
[0025]按照上述方法监测太平洋鳕孵化后仔稚鱼体内携带病毒的拷贝数，对出现病毒拷贝数上升的育苗池使用免疫诱导剂，提高仔稚鱼免疫力。
【权利要求】
1.一种检测太平洋鳕神经坏死病毒用试剂盒，有用于PCR反应的上游引物和下游引物以及神经坏死病毒基因的质粒标准品，其特征在于:所述上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID N0.2所示，所述神经坏死病毒基因的质粒标准品含有如SEQ ID N0.3所示序列。
【文档编号】C12Q1/70GK104178584SQ201410368037
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】毛明光, 姜志强, 蒋洁兰, 温施慧, 李幸 申请人:大连海洋大学, 毛明光