一种植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法
【专利摘要】本发明提供了一种植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法，包括如下步骤：步骤1，将自主分离与筛选得到的一株分杆菌株、种子斜面固体培养基和无菌水，恒温培养5-6天，得到种子；步骤2，将一级种子培养基溶于水，移入由步骤1得到的种子，在摇床上放置72h，得到一级种子；步骤3，将二级种子培养基溶于水，移入由步骤2得到的一级种子，反应48h，得到二级菌种；步骤4，将植物甾醇、豆油、吐温分别放入发酵罐中，同时加入生物转化培养基，移入步骤3得到的二级菌种，直至检测无植物甾醇残留为止，加热到90℃，静止3h，分出水层；步骤5，油层用有机溶剂萃取，减压浓缩到溶剂体积的1/4，冷却到5℃，过滤，得到粗品；用甲醇重结晶，得到4-雄烯二酮成品。
【专利说明】-种植物Η醇制备4-雄烯二酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物留醇制备4-雄烯二酮的方法。
【背景技术】
[0002] 4_雄烯二酮(化学名称：雄_4烯_3,17-二酮，英文名Anostenedione---简称AD)， 该产品外观形状呈近白色晶体粉末，无异味，无毒性，不溶于水，是留体类激素药物的重要 中间体。可以说几乎所有留体激素药物都可以以雄烯二酮为起始原料进行生产，如用于生 产皮质激素、性激素、孕激素及蛋白同化激素，又可用于制备可的松、强的松、黄体酮、雌烯 醇、地塞米松等100余种药物，也可以直接用于生产抗早孕米非司酮和各类计划生育用药 的必不可少的基本原料。留体药物具有很强的抗感染、抗病毒和抗休克等药理作用，广泛用 于治疗风湿病、心血管病、癌症、皮肤病等。留体药物的发现及成功合成是近半个世纪来医 药工业取得最引人注目的两大进展之一，成为仅次于抗生素的第二大类药物。合成原料一 般为薯蓣皂素、剑麻皂素、番麻皂素等，随着薯蓣资源日渐枯竭，使得留体药物工业不得不 寻求新的原料，而微生物降解胆固醇和植物留醇合成雄烯二酮（AD) D成为新兴的留体原料 吸引了人们的注意。
[0003] 中国专利文献CN103773832A公开了 一种从植物留醇水相发酵液中提取4-雄烯二 酮的方法，其特征在于，包括：采用植物留醇为原料进行微生物发酵生成4-雄烯二酮；将发 酵结束后的发酵液通过离心机进行液固分离，提取湿固体物料；在所述湿固体物料中加入 丙酮-纯水的混合溶剂，在升温至40-60°C的条件下持续搅拌60-90分钟后，在40°C以上的 温度条件下进行固液分离，其中，每千克湿固体物料加入4升混合溶剂，所述混合溶剂中丙 酮的比例为70?80wt% ;对固液分离后得到的溶液进行结晶处理，所述结晶处理包括：将所 述溶液升温至40-60°C，使所述溶液中包含的4-雄烯二酮全部溶解，对所述溶液逐渐降温 至0-KTC后保温0. 5-2. 0小时，降温速度为每小时5?7°C，所述结晶的过程中持续搅拌， 搅拌的速度为15?25r/min ;对结晶后的物料进行离心得到4-雄烯二酮的粗品，对所述粗 品进行精制得到4-雄烯二酮成品。
[0004] 中国专利文献CN 103159816 A公开了一种从植物甾醇发酵液中提取4-雄烯二酮 的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤：（1)收集发酵液中的菌丝体及渣料：通过板框 压滤机或碟片式离心机收集发酵液中的菌丝体及渣料；（2)提取4-雄烯二酮粗品（I ):将 步骤（1)的菌丝体及渣料用1:〇.5~4 (W/V)丙酮在常温条件下浸提:Γ5次，每次l~3h，合并 丙酮浸提液，于〇?4°C静置5h，离心收集滤液和未反应的植物甾醇，滤液在45°C、_0. 095MPa 条件下减压蒸发回收丙酮，当有大量结晶出现时停止浓缩，冷却至4°C养晶3h，离心收集晶 体，即得粗品（I ); (3)制备4-雄烯二酮纯品：用1:15?25 (W/V)50wt%的丙酮水溶液溶解粗 品（I )，加热回流，过滤，滤液冷却至4°C搅拌结晶3h，离心收集粗品（II);粗品（II)用1:10 (W/V)乙醇加热回流溶解，加入0. f 1. Owt% (W/V)活性碳搅拌脱色30min，过滤，滤液冷却 至4°C搅拌结晶3h，离心，用少量冰乙醇洗涤晶体，于45°C、-0. 095MPa真空干燥5?8h得纯 品4-雄烯二酮。
[0005] 中国专利文献CN102432657 A公开了 一种从植物甾醇发酵液中提取纯化4-雄烯 二酮的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1)取植物留醇发酵液加热，加入中性盐使 分层，收集上层，得第一油相；2)用乙酸乙酯萃取所述第一油相，收集上层，加热减压蒸馏， 得第二油相；3)用甲醇萃取所述第二油相，收集上层，加热减压浓缩，降温结晶，得4-雄烯 二酮粗品；4)向4-雄烯二酮粗品中加入乙酸乙酯，加热溶解，加水搅拌，静置分层，取乙酸 乙酯层，降温结晶；5)向步骤4)所得结晶中加入甲醇溶解，脱色，结晶，得到4-雄烯二酮纯 品。
[0006] 中国专利文献CN103382445 A公开了一种用于制备雄烯二酮的微生物菌株，其 保藏号为CCTCC N0:M2012522。利用上述菌株制备雄烯二酮的步骤包括：A、一级种子罐 发酵，菌株的接种量为〇· 5-1. 5wt%，在27-35°C，160-200rpm，0. 03-0. 07MPa条件下培养 30-42h ;B、二级种子罐发酵，菌株的接种量为8-12wt%，同条件下培养20-30h ;C、发酵罐发 酵转化生成雄烯二酮，菌株的接种量为10-14%;在27-35°C，0. 03-0. 07MPa条件下培养；D、 停止转化：甾醇低于〇. 5%，PH8. 9-9. 0,放罐，升温到90-100°C维持30-50min，然后冷却到 30-50°C，停止搅拌，静置4-6小时。本发明提供了一种分枝杆菌的高效发酵菌株，同时利用 表面活性剂、豆油与发酵液形成双向系统，改进发酵工艺，极大的提升了原料的投料量和微 生物的转化率。
[0007] 中国专利文献CN 103789386A公开了由植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4烯-3， 17二酮和/或雄留-1，4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于在具有诺卡氏菌属或分支杆 菌属微生物的反应器中加入用含有十二烷基硫酸钠的增溶剂或乳化剂和植物留醇组合物， 调节PH值大于7,在20-37°C之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为雄甾-4烯-3,17二 酮和/或雄甾-1，4-二烯-3,17二酮。
[0008] 从现有技术来看，植物留醇的投料量和4-雄烯二酮的收率还有待优化。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提高植物留醇的投料浓度和4-雄烯二酮的收率。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种一种植物留醇制备4-雄烯二酮的方 法。
[0011] 本发明通过由自主分离与筛选得到的一株分杆菌株的传代接种、一级种子培养、 二级种子培养、生物转化、萃取、精制得到4-雄烯二酮。
[0012] 具体地，本发明包括如下步骤 步骤1，将自主分离与筛选得到的一株分杆菌株、种子斜面固体培养基和无菌水，控制 pH=6. 90-7. 30,在31 °C恒温培养5-6天，然后在4°C保存；得到种子； 步骤2,将一级种子培养基溶于水，控制pH=6. 90-7. 30,在121-125°C灭菌30min，移入 由步骤1得到的种子，在转速170r/min，温度31-33°C的摇床上，放置72h ;得到一级种子， 检测合格后，即可进行二级接种； 步骤3,将二级种子培养基溶于水，控制pH=7. 90-8. 10,在121-125°C灭菌30min，移入 由步骤2得到的一级种子，在转速170r/min，温度31-33°C，通气流量0. 3m3/h，反应48h ;得 到二级菌种，检测合格后，即可进行生物转化； 步骤4,将植物留醇、豆油、吐温分别放入发酵罐中，同时加入生物转化培养基，在 121-125°C灭菌30min，冷却到33-34°C，移入步骤3得到的二级菌种，压力控制在0. 05MPa， 通气流量3. 5m3/h，温度控制在33-34°C，转速控制在300-350r/min，直至检测无植物留醇残 留为止；加热到90°C，静止3h，分出水层； 步骤5,油层用有机溶剂萃取，减压浓缩到溶剂体积的1/4,冷却到5°C，过滤，得到粗 品；用甲醇重结晶，得到4-雄烯二酮成品。
[0013] 本发明的具有以下优点： 1、本发明通过由自主分离与筛选得到的一株分杆菌株的传代接种、一级种子培养、二 级种子培养、生物转化、萃取、精制得到4-雄烯二酮。优化了工艺参数。提高了植物留醇的 浓度和4-雄烯二酮的收率，保证了产品质量。
[0014] 2、本发明提高了植物留醇的发酵浓度（2. 2wt%)。植物留醇的微生物转化过程中， 底物在水溶液培养基中的溶解度是主要问题。为了提高底物的浓度，本发明采用在体系中 加入适量的溶剂和表面活性剂，底物浓度达到2. 2wt%时，菌体代谢正常。目前国内报道底 物浓度最高的是天津药业的1. 5wt%。
[0015] 3、本发明4-雄烯二酮的收率（38wt%)。植物留醇的微生物转化，主要生成两种物 质，4-雄烯二酮和1，4-雄烯二酮。要提高4-雄烯二酮的收率，就必须降低1，4-雄烯二酮 的生成量，本发明采用自主分离与筛选得到的一株分杆菌株，对4-雄烯二酮有很高的选择 性，收率达到38wt%。目前国内报道4-雄烯二酮的收率最高的是天津药业的32wt%。
[0016] 4、本发明具有发酵工艺简单，投料浓度高，产品收率高，成本低，市场竞争明显等 特点。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例对本发明作进一步说明。
[0018] 实施例1 第一步：将自主分离与筛选得到的一株分杆菌株、4g酵母膏、6g蛋白胨、18g葡萄糖、 23g琼脂加到到母瓶里，用水定容到1L，调节pH=6. 90-7. 30,在31°C (可以是在25-36°C之 间）恒温培养5天，然后在4°C (可以是在2-6°C之间）保存。
[0019] 第二步：将4g酵母膏、6g蛋白胨、18g葡萄糖加到摇瓶中，用水定容到1L，调节 ρΗ=6·90-7·30,在121-125°C灭菌30min，冷却到30°C (可以是在25-32°C之间），移入第一 步培养的种子，在转速170r/min，温度31-33°C的摇床上，放置72h。检测菌丝量3wt%左右 后，即可进行二级接种。
[0020] 第三步：将162.5g玉米浆、49g蔗糖、44. lg硝酸钾、4.9g磷酸氢二铵、2.6g消 泡剂加到发酵罐中，加水到6. 5Kg，调节pH=7. 90-8. 10,在121-125°C灭菌30min，冷却到 30°C (可以是在25-32°C之间）。移入200g第二步得到的一级菌种，在转速170r/min，温度 31-33°C下，压力0. 05Mpa，通气流量控制在0. 3m3/h，检测菌丝量10wt%左右后，即可进行生 物转化。
[0021] 第四步：将1625g玉米浆、409. 5g硝酸钾、45. 5g磷酸氢二铵、10L豆油、15ml吐温、 1625g植物留醇和2600g乙醇组成的溶液加到发酵罐中，加水加到65Kg，在121-125°C灭 菌30min，冷却到33-34°C，移入第三步得到的二级菌种，流量控制在3. 5 m3/h，压力控制在 0. 05mpa，温度控制在33_34°C，转速控制在300_350r/min，直至检测无植物留醇残留为止。 加热到90°C，静止3h，分出水层。
[0022] 第五步：油层用4倍量的乙酸乙酯萃取，减压浓缩到溶剂体积的1/4,冷却到5°C， 过滤，得到粗品。用10倍量甲醇重结晶，得到618g4_雄烯二酮成品。
[0023] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是 作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本 发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范 围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1. 一种植物留醇制备4-雄烯二酮的方法，其特征在于包括： 步骤1，将自主分离与筛选得到的一株分杆菌株、种子斜面固体培养基和无菌水，控制 pH=6. 90-7. 30,在31 °C恒温培养5-6天，然后在4°C保存；得到种子； 步骤2,将一级种子培养基溶于水，控制pH=6. 90-7. 30,在121-125°C灭菌30min，移入 由步骤1得到的种子，在转速170r/min，温度31-33°C的摇床上，放置72h ;得到一级种子； 步骤3,将二级种子培养基溶于水，控制pH=7. 90-8. 10,在121-125°C灭菌30min，移入 由步骤2得到的一级种子，在转速170r/min，温度31-33°C，通气流量0. 3m3/h，反应48h ;得 到二级菌种； 步骤4,将植物留醇、豆油、吐温分别放入发酵罐中，同时加入生物转化培养基，在 121-125°C灭菌30min，冷却到33-34°C，移入步骤3得到的二级菌种，压力控制在0. 05MPa， 通气流量3. 5m3/h，温度控制在33-34°C，转速控制在300-350r/min，直至检测无植物留醇残 留为止；加热到90°C，静止3h，分出水层； 步骤5,油层用有机溶剂萃取，减压浓缩到溶剂体积的1/4,冷却到5°C，过滤，得到粗 品；用甲醇重结晶，得到4-雄烯二酮成品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述种子斜面固体培养基为： 酵母膏0. 4wt%，蛋白腺0. 6wt%，葡萄糖1. 8wt%，琼脂2. 3wt%。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述一级种子培养基为：酵母 膏0. 4wt%，蛋白腺0. 6wt%，葡萄糖1. 8wt%。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述二级种子培养基为：玉米 浆2. 5wt%，硝酸钾0· 63wt%，蔗糖0· 7wt%，磷酸氢二铵0· 07wt%，消泡剂0· 04wt%。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中，所述生物培养基为：玉米 楽2. 5wt%，硝酸钾0. 63wt%，磷酸氢二铵0. 07wt%，豆油16 (v/v)，吐温0. 02wt%，植物甾醇 2.5wt%〇
【文档编号】C12R1/32GK104195209SQ201410441970
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】吴卫忠, 蒋澄宇 申请人:常州大学