一种从小球藻中提取多糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从小球藻中提取多糖的方法，包括将小球藻种进行多级培养和将培养所得小球藻采用无机碱溶液进行提取的步骤，其中小球藻种一级培养采用的是不含葡萄糖的培养基。本发明的方法所得小球藻生物量产量高，从所得小球藻中可以简捷方便的获得小球藻的主要成分：小球藻多糖。与传统方法相比较，本发明方法易行、操作方便、安全可靠且所用设备简单、成本低，适用于工业化规模生产。
【专利说明】一种从小球藻中提取多糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从小球藻中提取获得小球藻多糖类物质的方法，属于化工领域。
【背景技术】
[0002] 小球藻属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属，是一种球形单细胞淡 水藻类，直径3?8微米，是一种高效的光合植物，分布极广。小球藻中富含各种营养物质， 其中碳水化合物（糖类）10%?25%，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力等活 性。目前市场上的同类多糖产品是从大型海藻中，如红藻和褐藻，提取得到，对于小球藻中 的绿藻多糖的研究较少有成功的先例。
[0003] 究其原因，主要是受到两个因素的限制，一方面是小球藻进行光合自养时，生物量 较低，一般为0. 2?0. 8g/L，不适用工业生产；另一方面是传统的多糖类成分提取方法成本 高，不易推广应用。
[0004] 已有的藻类中多糖成分的提取方法是热水浸提法，此法提取温度较高、提取时间 较长并且提取效率低下。例如谢作明、刘永定等发明的"一种从纤细席藻中提取多糖的方 法"（CN200810046770. 4)，是向纤细席藻粉中加入7?10倍重量的蒸馏水，搅匀，然后在 70?90°C下，搅拌抽提3?5小时，收集上清液，除蛋白、醇沉得纤细席藻多糖。刘永定、沈 银武等发明的"一种利用水华蓝藻提取多糖的方法"（CN200410012927. 3)，是向蓝藻藻粉中 加入15?20倍重量的蒸馏水，充分湿润，浸泡2-3小时，然后在70?92°C下，利用搅拌器 不停地搅拌抽提3?5小时，收集上清液，除蛋白、醇沉得蓝藻多糖，类似方法还有很多，例 如CN200510038387. 0、CN200810015880. 4等也公开了针对其它藻类的多糖提取方法，这些 方法一方面不是针对小球藻设计的，用于小球藻中多糖物质的提取产率较差，无实际应用 价值；另一方面都是采用高温热水浸提耗时太长，虽然采用蛋白酶作为催化剂能够提高提 取速度，但是成本大幅升高。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种从小球藻中提取多糖的方法，通过小球 藻培养条件和提取方法的改进，从小球藻生物量产量和多糖提取产率两方面入手，不仅提 高了单位培养环境内小球藻中绿藻多糖的产率，而且设备需求低且能耗较少，提取成本低。
[0006] 为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0007] -种从小球藻中提取多糖的方法，包括将小球藻种进行多级培养和将培养所得小 球藻采用无机碱溶液进行提取的步骤，其中小球藻种一级培养采用的是不含葡萄糖的培养 基。
[0008] 其中，在进行二级培养时，采用含葡萄糖的培养基培养小球藻种是为了提高小球 藻的生物产量，从而提高单位小球藻中多糖的含量，为后续的多糖提取提供良好的基础。
[0009] 上述所用的不含葡萄糖的培养基，可以选择藻类植物培养领域可用的任意不含葡 萄糖的培养基，优选的，考虑到小球藻的生长特性，该培养基的组成为硝酸钠1. 〇?3. 0g、 磷酸氢二钾0. 02?0. 08g、硫酸镁0. 01?0. 06g、氯化钙0. 002?0. OlOg、柠檬酸0. 001? 〇. 〇〇7g、柠檬酸铁铵0. 002?0. 008g、乙二胺四乙酸二钠盐0. 0005?0. 004g、碳酸钠 0. 005?0. 05g，微量元素溶液0. 5?2. 0ml，以1000g水作为溶剂。
[0010] 其中，上述的微量元素溶液可采用市售的藻类培养基中所用的微量元素溶液成 品，例如微量元素溶液A5(1000ml 水中溶解!^03约2. 86g、MnCl2 ·4Η20约 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 约 0· 222g、Na2Mo04 约 0· 39g、CuS04 · 5Η20 约 0· 079g、Co (Ν03)2· 6Η20 约 0· 049g，不同厂家的 产品各成分含量略有变化）。
[0011] 其中，所述培养采用两级培养法，一级培养将小球藻种在不含葡萄糖的培养基中 静止培养，二级培养是将一级培养所得培养物稀释在含葡萄糖的培养基培养基中静止培养 继续培养。
[0012] 其中，上述二级培养所用培养基可以是本领域常用含葡萄糖的藻类培养基，优选 的，为了保持小球藻生长的稳定性，二级培养所用的含葡萄糖的培养基是在一级培养所用 不含葡萄糖的培养基溶液中加入适当浓度的葡萄糖即可。
[0013] 上述一级培养与二级培养的稀释关系可根据实际条件进行调整，通常是按照吸光 度将一级培养所得的培养物稀释成吸光度值为0. 2左右的稀释藻液作为二级培养的基础。
[0014] 上述的培养条件可采用藻类培养领域常见环境，结合小球藻的生长特性和所用培 养基的性质，优选一级培养、二级培养的培养条件为光照强度3000?50001u X，温度20? 25°C，培养时间5?8天。
[0015] 通过上述培养条件，可以有效提高小球藻的生物量达到1?2g/L。
[0016] 在提取阶段，所用无机碱溶液可以是任意弱碱性无机化合物，优选为pH值为8? 12的氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。
[0017] 所采用的提取方法可以是常见藻类的提取方法，优选为将培养所得小球藻藻液离 心获得小球藻藻泥，将其冷冻干燥后研磨粉碎得到小球藻粉；将小球藻粉加入到无机碱溶 液中混匀离心收集上清液，浓缩、醇沉，即可得小球藻多糖。
[0018] 在此基础上，进一步还包括将所得小球藻多糖纯化和收集的步骤：将所得小球藻 多糖白色絮状物用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤沉淀物，然后将其离心收集多糖沉淀物。
[0019] 最后得到的多糖沉淀物经冷冻干燥后即为小球藻多糖成品。
[0020] 上述提取方法最终的产率为12?15%左右，显著优于传统的提取方法（一般只能 达到3-5 %左右）。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 本发明通过以下步骤从小球藻Chlorella sp. -YL中提取多糖：
[0023] A、培养液的配制
[0024] 按每升水加入硝酸钠 L 5g、磷酸氢二钾0· 065g、硫酸镁0· 055g、氯化钙0· 0072g、 柠檬酸0. 〇〇66g、柠檬酸铁铵0. 006g、乙二胺四乙酸二钠盐0. 0012g、碳酸钠0. 02g，微量元 素溶液1. 〇ml。
[0025] 其中微量元素溶液按每升水水加入硼酸2. 86g、四水氯化锰1. 86g、七水硫酸锌 0. 22g、二水钥酸钠 0. 39g、五水硫酸铜0. 08g、六水合硝酸钴0. 05g,完全溶解后搅匀。
[0026] 二级培养所用培养基溶液在上述基础上额外加入1% (质量分数）的葡萄糖，即每 升水加入l〇g葡萄糖。
[0027] B、小球藻的培养
[0028] (1) -级培养：将小球藻种接入装有不含葡萄糖的培养液的200mL锥形瓶中静止 培养，每天摇瓶3次，以确保均匀的光照以及C0 2的通入和02的及时释放，光照强度控制在 40001ux，温度控制在25°C，当培养6天后，转入到二级培养。
[0029] (2)二级培养：将一级培养所得的培养物稀释，得到吸光度值为0. 2的稀释藻 液后，接入到装有新的含葡萄糖培养液的2000ml锥形瓶中，无菌处理，光照强度控制在 4000lux，温度控制在25°C，当培养6天后，收获。
[0030] 经统计，生物量为1. 8g/L。
[0031] C、小球藻粉的制备
[0032] 将小球藻藻液离心获得小球藻藻泥，然后将小球藻藻泥在_50°C冷冻干燥，研磨粉 碎后得到小球藻粉。
[0033] D、小球藻多糖的提取
[0034] 向小球藻粉中加入25倍体积、pH值为10.94的氢氧化钠溶液，超声振荡混匀 lOmin，然后在96. 4°C提取3. 2h，在5000rpm条件下离心lOmin，收集上清液，浓缩至原体 积的约1/3,加入3倍体积95 %的乙醇溶液，在4°C冰箱中沉淀过夜，在5000rpm条件下离 心lOmin，得到絮状沉淀物，将此沉淀物溶于蒸馏水中，按4 : lv/v加入氯仿-正丁醇（按 4 : l，v/v配制）溶液，利用混匀器充分振荡lmin，离心，收集上层清液，再按比例加入氯 仿-正丁醇溶液，重复上述步骤3次，收集最终得到的上清液，加入3倍体积95%的乙醇溶 液，在在4°C冰箱中沉淀过夜，在5000rpm条件下离心lOmin，得到白色絮状沉淀物即为小球 藻多糖，收集多糖，以此沉淀物为计算指标，产率为19. 4%。
[0035] E、纯化、收获与干燥
[0036] 纯化：将白色絮状物用无水乙醇洗涤，；再用可溶于水的丙酮洗涤，确保水分除净； 最后用无水乙醚洗涤沉淀物，除去残存的乙醇、丙酮和溶于其中的水分。
[0037] 收获：将上述溶液在离心机中8000rpm离心8min，收集多糖沉淀物，以此多糖沉淀 物为计算指标，提取产率为14. 2% ;
[0038] 干燥：将收集到的多糖沉淀物在_50°C冷冻干燥，得多糖产品。
[0039] 实施例2
[0040] 本发明通过以下步骤从小球藻Chlorella sp. -YL中提取多糖：
[0041] A、培养液的配制
[0042] 按每升水加入硝酸钠2. 6g、磷酸氢二钾0. 037g、硫酸镁0. 015g、氯化钙0. Olg、柠 檬酸0. 0027g、柠檬酸铁铵0. 002g、乙二胺四乙酸二钠盐0. 0038g、碳酸钠0. 04g，微量元素 溶液1. 8ml，其中微量元素溶液按每升水水加入H3B032. 86g、MnCl2 ·4Η20 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 0· 222g、Na2Mo040 . 39g、CuS04 · 5Η200· 079g、Co (N03) 2· 6H20 0· 049g，完全溶解后搅匀。
[0043] B、小球藻的培养
[0044] (1) -级培养：将小球藻种接入装有不含葡萄糖的培养液的200mL锥形瓶中静止 培养，每天摇瓶3次，以确保均匀的光照以及C0 2的通入和02的及时释放，光照强度控制在 45001ux，温度控制在25°C，当培养5天后，转入到二级培养。
[0045] (2)二级培养：将一级培养所得的培养物稀释，得到吸光度值为0. 2的稀释藻液 后，接入到装有新的含有葡萄糖培养液的2000ml锥形瓶中，无菌处理，光照强度控制在 35001ux，温度控制在25°C，当培养6天后，收获。
[0046] 经统计，生物量为1. 82g/L。
[0047] C、小球藻粉的制备
[0048] 将小球藻藻液离心获得小球藻藻泥，然后将小球藻藻泥在_55°C冷冻干燥，研磨粉 碎后得到小球藻粉。
[0049] D、小球藻多糖的提取
[0050] 向小球藻粉中加入22倍体积、pH值为10. 2的氢氧化钠溶液，超声振荡混匀 15min，然后在85. 1°C提取3h，在4580rpm条件下离心12min，收集上清液，浓缩至原体积 的约1/3,加入2倍体积95%的乙醇溶液，在4°C冰箱中沉淀过夜，在5000rpm条件下离心 15min，得到絮状沉淀物，将此沉淀物溶于蒸馏水中，按4 : lv/v加入氯仿-正丁醇（按 4 : l，v/v配制）溶液，利用混匀器充分振荡2min，离心，收集上层清液，再按比例加入氯 仿-正丁醇溶液，重复上述步骤5次，收集最终得到的上清液，加入3倍体积95%的乙醇溶 液，在在4°C冰箱中沉淀过夜，在6000rpm条件下离心5min，得到白色絮状沉淀物即为小球 藻多糖，收集多糖，以此沉淀物为计算指标，产率为18. 8%。
[0051] E、纯化、收获与干燥
[0052] 纯化：将白色絮状物用无水乙醇洗涤，；再用可溶于水的丙酮洗涤，确保水分除净； 最后用无水乙醚洗涤沉淀物，除去残存的乙醇、丙酮和溶于其中的水分。
[0053] 收获：将上述溶液在离心机中8000rpm离心8min，收集多糖沉淀物，以此多糖沉淀 物为计算指标，提取产率为14. 7% ;
[0054] 干燥：将收集到的多糖沉淀物在_50°C冷冻干燥，得多糖产品。
【权利要求】
1. 一种从小球藻中提取多糖的方法，其特征在于包括将小球藻种进行多级培养和将培 养所得小球藻采用无机碱溶液进行提取的步骤，其中小球藻种一级培养采用的是不含葡萄 糖的培养基。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述不含葡萄糖的培养基的组成为硝酸钠 1. 0?3. Og、磷酸氢二钾0· 02?0· 08g、硫酸镁0· 01?0· 06g、氯化钙0· 002?0· OlOg、柠檬 酸0· 001?0· 007g、柠檬酸铁铵0· 002?0· 008g、乙二胺四乙酸二钠盐0· 0005?0· 004g、 碳酸钠〇. 005?0. 05g，微量元素溶液0. 5?2. 0ml，以1000g水作为溶剂。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用两级培养法，一级培养将小球藻种在 不含葡萄糖的培养基中静止培养，二级培养是将一级培养所得培养物稀释在含葡萄糖的培 养基中静止培养继续培养。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于一级培养、二级培养的培养条件为光照强 度3000?50001ux，温度20?25°C，培养时间5?8天。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述无机碱溶液为pH值为8?12的氢氧 化钠溶液和/或氢氧化钾溶液。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于提取方法是将培养所得小球藻藻液离心获 得小球藻藻泥冷冻干燥后研磨粉碎得到小球藻粉，将小球藻粉加入到无机碱溶液中混匀离 心收集上清液，浓缩、醇沉，即可得小球藻多糖。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于进一步将所得小球藻多糖纯化和收集的步 骤：将所得小球藻多糖白色絮状物用无水乙醇、丙酮和无水乙醚洗涤沉淀物，然后将其离心 收集多糖沉淀物。
【文档编号】C12P19/04GK104195198SQ201410441944
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】徐小琳, 贺莹莹, 代斌, 王长海 申请人:石河子大学