一种提高微藻油脂产率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高微藻油脂产率的方法，首先将微藻在存在植物激素的改良培养基中进行光自养培养，到稳定期后将离心获得的藻体作为种子在胁迫培养基中进行光胁迫、氮胁迫培养。本发明公开的方法降低了培养过程对营养物质的需求量，降低了培养成本，能够同时提高小球藻的生物量和油脂产率，培养方法简单、易操作、不易污染，所受影响因素较少，适合大规模培养。
【专利说明】一种提高微藻油脂产率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高微藻油脂产率的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 微藻是一类体较小的单细胞藻类，具有含油量高、生长速度快、光合效率高、环境 适应力强、不占用耕地等特点，并且微藻体内的油脂可通过酯交换反应生成脂肪酸甲酯，即 生物柴油，被认为是发展生物柴油最具潜力的原料。尽管微藻具有如此多的优点，但是利用 微藻生产生物柴油成本高于石油为主的石化燃料，在这之中获取具有高油脂产率的微藻种 质资源是发展生物柴油的关键步骤之一。
[0003] 高油脂产率的微藻需要微藻具有积累较高生物量和油脂含量的能力，微藻的生长 过程易受到外界环境因素的影响，如培养基成分、光照强度、盐度、pH等，以及不同的培养方 式，如异养、兼养、光自养等，都会导致微藻细胞内各类生化物质的含量不同。
[0004] 陈必链等（01'11010165144)通过微波处理微藻可使微藻生物量提升10(%?60 (%, 但该方法设备投入多、能耗大，生产成本较高；张霖等（CN 102443562A)通过在培养基中添 加含羟基的三碳有机物光自养培养微藻，使小球藻生物量提高至500mg/L以上；李元广等 人（CN 102154110A)通过先异养后自养培养步骤，使普通小球藻生物量达到2g/L以上，油 脂产率达到150mg/L ·(!以上；王艳等人（CN 103045478A)通过交替添加碳源或氮源使得产 油小球藻生物量高达18g/L，油脂含量高达48%;以上通过异养或兼养方式能显著提高微藻 生物量，但培养中易染菌，所需设备要求较高，随之能耗也相对较高，并且这种方法不适宜 户外大规模培养微藻。光自养微藻较异养与兼养方式相比，培养过程更为简单，对设备及营 养要求低，成本投入少，但微藻油脂产率不如以上两种方式高，因此探寻一种能快速提高光 自养微藻油脂产率的方法尤为重要。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种提高微藻中油脂产率的方法，通过微藻， 主要是小球藻在植物激素存在的光自养条件下获得的浓缩藻体为种子进行光、氮胁迫培 养，得到高油脂产率的胁迫条件，从而实现胁迫环境中生物量和油脂含量同步提高。与传统 方法相比，本发明的方法操作简单，成本较低，适用于大规模培养微藻用于生物柴油的生产 和研究。
[0006] 为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
[0007] -种提高微藻油脂产率的方法，首先将小球藻在存在植物激素的基础培养基中进 行光自养培养，到稳定期后将离心获得的浓缩藻体作为种子在胁迫培养基中进行光胁迫、 氮胁迫培养；其中基础培养基为改良BG11培养基，胁迫培养基与基础培养基相比，NaN0 3浓 度低于基础培养基或不含基础培养基，其余成分相同；胁迫培养条件下光照强度高于基础 培养。
[0008] 在本发明中，微藻主要是指最常见的用于生产生物柴油的微藻品种：小球藻，整个 培养条件的培养基的优化以小球藻为基础。
[0009] 通过上述方法，在氮源缺乏环境中，即氮胁迫，抑制小球藻体内蛋白质和核酸等含 氮类化合物的合成，促进含氮元素较少的脂类和绝大多数膜质继续合成，使其油脂含量增 力口；同时，在基础培养阶段利用植物激素促进藻体的生长，使细胞液泡和细胞体积不断增 大，促进RNA和蛋白质的合成，为合成原生质体和细胞壁提供原料，从而使培养所获得的微 藻生物量较高。
[0010] 其中，所述基础培养基组成为 NaN03 0 . 4 ?1. 5g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H20 0. 04 ?0. 16g/ L，MgS04 · 7H20 0· 08 ?0· 24g/L，CaCl2 20 ?30mg/L，柠檬酸 3 ?9mg/L，Fe (NH4) 3 (C6H507) 2 2.0?9.011^/1，似#0了4*2!120 0.6?1.811^/1，似2〇)315?3011^/1，微量元素混合液0.1? 1. OmL/L，NaHC03 1 ?3g/L。 toon] 其中，上述的微量元素溶液可采用市售的藻类培养基中所用的微量元素溶液成 品，例如微量元素溶液A5(1000ml 水中溶解!^03约2. 86g、MnCl2 ·4Η20约 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 约 0· 222g、Na2Mo04 约 0· 39g、CuS04 · 5Η20 约 0· 079g、Co (Ν03)2· 6Η20 约 0· 049g，不同厂家的 产品各成分含量略有变化）。
[0012] 在本发明，植物激素可以是常见的生长素 IAA、赤霉素（GA)、细胞分裂素（CTK)、脱 落酸（abscisic acid，ΑΒΑ)等，可根据需要调整激素的用量，结合上述培养基和小球藻的生 长特性，优选基础培养基中加入的植物激素为三吲哚乙酸，其浓度为〇. 01?〇. 50mg/L。
[0013] 在本发明中，胁迫培养基的成分与基础培养基相同，但是含氮的成分含量更低或 不使用以实现氮胁迫，具体的，胁迫培养基组成为NaN0 3浓度为0?0. 4g/L，其余与基础培 养基相同。
[0014] 在本发明中，基础培养基培养条件为温度20?28°C，光照强度3000?60001ux， 光周期24:0。
[0015] 与上述条件相比，在胁迫培养基阶段光照强度更高以实现光胁迫，具体的，胁迫培 养基培养条件为光照强度7000?lOOOOlux，其余与基础培养基培养条件相同。
[0016] 在本发明中，浓缩藻体的方法为微藻经植物激素处理培养至稳定期后，4000? 5000r/min离心藻液5?8min，无菌水冲洗藻泥4?5次，获得浓缩藻体。
[0017] 通过上述改进，本发明在植物激素培养和光、氮胁迫培养下，微藻油脂产率显著提 高。与传统方法相比较，本发明通过植物激素的添加与胁迫培养降低对营养物质的需求量， 减少投入成本，二者集成的方法能高效提高油脂产率，与异养发酵条件相比，光自养培养方 法简单、易操作、不易污染，所受影响因素较少，更适合大规模培养。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1为本发明培养方法的示意图。
【具体实施方式】
[0019] 在下述实施例中，实验藻种为小球藻C. vulgaris XJB，来自石河子大学化学化工 学院，新疆兵团化工绿色过程重点实验室，也可从市场上购买。
[0020] 参考附图1，可理解本发明方法的具体实施步骤和过程。
[0021] 实施例1
[0022] 取适量C. vulgaris XJB藻液接种至含600mL培养基的1L锥形瓶中，藻液接种 量为 10%，培养基为：NaN03 0· 83g/L，Κ2ΗΡ04 · 3H20 0· 09g/L，MgS04 · 7H20 0· 12g/L，CaCl2 27. 2mg/L, Citric-acid 6. 6mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H507) 2 6. Omg/L, Na2EDTA · 2H20 1. lmg/L, NaC03 20mg/L，A5微量元素混合液0. 2mL/L，NaHC03 2. 34g/L。向基础培养基中添加三吲哚 乙酸IAA 0. 08mg/L，于温度24±2°C，光照强度6000±2001ux，光周期24:0(L:D)下光自养 培养，每天摇瓶三次。
[0023] 通过每天定时检测的细胞个数所绘制的生长曲线，于稳定期4000r/min离心藻液 5min，获得浓缩藻体，并以蒸馏水冲洗5次，洗去无机盐离子后全部悬浮在NaN0 3浓度为Og/ L而其他营养成分同上所述基础培养基的胁迫培养基中，于光照强度为70001ux，光周期为 24:0 (L: D)，温度为24 ± 2 °C条件下，胁迫培养2天。
[0024] 检测细胞生长至稳定期后，藻液于4000?5000r/min离心5?8min，藻泥冷冻干 燥10?12h，干藻粉称重后即为生物量。
[0025] 小球藻干藻粉采用氯仿甲醇法提取油脂：取适量小球藻干粉于10mL离心管中，力口 入6mL的氯仿甲醇混合液（2 : 1，V : V)，室温下静置0.5h后加入lmL蒸馏水，将混合物 在混勻器中润旋30s，室温静置2h后于5000r · mirT1离心5min，收集氯仿层至已恒重且已 知质量的试管中。取4mL氯仿加入到上述离心管中，涡旋30s后室温静置2h，离心收集氯仿 层于上述试管中，将试管在通风橱中70°C水浴蒸干，置于105°C烘箱中烘干至恒重，冷却至 室温后称量试管质量，前后质量之差为微藻总脂质量，计算油脂含量及油脂产率。
[0026] 检测结果显示，小球藻经上述IAA培养和光、氮胁迫培养后，C. vulgaris XJB油脂 产率可达49. 6mg/L · d，与仅经IAA培养的条件相比提高了 2. 3倍，与未经IAA培养条件相 比提高了 5. 4倍。
[0027] 实施例2
[0028] 本实施例所用小球藻及IAA光自养培养过程同实施例1。
[0029] 其中，IAA处理后所获藻泥悬浮至胁迫条件下，S卩NaN03浓度为0. 20g/L，其他营养 成分同实施例1所述培养基的胁迫培养基中，于光照强度为80001UX，光周期为24:0 (L:D)， 温度为24±2°C条件下，胁迫培养2天。
[0030] 胁迫培养至稳定期后，生物量、油脂含量、油脂产率检测及计算同实施例1，经上述 IAA光自养光、氮胁迫培养后，C. vulgaris XJB油脂产率可达57. 9mg/L ·(!，与仅经IAA 培养的条件相比提高了 2. 8倍，与未经IAA或胁迫培养条件相比提高了 6. 5倍。
【权利要求】
1. 一种提高微藻油脂产率的方法，其特征在于首先将小球藻在存在植物激素的基础培 养基中进行光自养培养，到稳定期后将离心获得的浓缩藻体作为种子在胁迫培养基中进行 光胁迫、氮胁迫培养；其中基础培养基为改良BG11培养基，胁迫培养基与基础培养基相比， NaN03浓度低于基础培养基或不含基础培养基，其余成分相同；胁迫培养条件下光照强度高 于基础培养。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基础培养基组成为NaN03 0 . 4?1. 5g/ L，K2HP04 ·3Η20 0· 04 ?0· 16g/L，MgS04 ·7Η20 0· 08 ?0· 24g/L，CaCl2 20 ?30mg/L，柠檬酸 3 ?9mg/L，Fe (NH4) 3 (C6H507) 2 2· 0 ?9. Omg/L，Na2EDTA · 2H20 0· 6 ?1. 8mg/L，Na2C03 15 ? 30mg/L，微量元素混合液 0· 1 ?1. OmL/L，NaHC03 1 ?3g/L。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于基础培养基中加入的植物激素为三Π 引哚乙 酸，其浓度为〇· 01?〇· 50mg/L。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述胁迫培养基组成为NaN03浓度为0? 〇. 4g/L，其余与基础培养基相同。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基础培养基培养条件为温度20? 28°C，光照强度3000?60001ux，光周期24:0。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述胁迫培养基培养条件为光照强度 7000?lOOOOlux，其余与基础培养基培养条件相同。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于浓缩藻体的方法为微藻经植物激素处理培 养至稳定期后，4000?5000r/min离心藻液5?8min，无菌水冲洗藻泥4?5次，获得浓缩 藻体。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述微藻为小球藻。
【文档编号】C12P7/64GK104195189SQ201410441942
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】徐小琳, 王思雨, 李春, 王长海 申请人:石河子大学