多色fish用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及多色FISH用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒，包括如下步骤：对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用多色FISH探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。本发明的肺癌相关融合基因FISH检测方法通过对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用高分辩多色FISH进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。本法设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快速，准确，直观检测出肺癌相关ALK-EML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师对肺癌进行精确分子分型的参考依据，适于大规模推广应用。
【专利说明】多色FISH用于筛查肺癌融合基因的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及疾病相关基因检测【技术领域】，具体的，涉及肺癌相关融合基因检测技 术领域，特别是指一种肺癌相关融合基因 FISH检测方法和相关检测探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。 近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率 均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不 完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。
[0003] 根据肺癌的生长、侵犯及转移速度和范围以及对化疗药物和放射治疗的敏感性， 临床将肺癌分为小细胞肺癌（SCLC)及非小细胞肺癌（NSCLC)，后者占肺癌发病率80%左 右。只有合理应用手术、放疗、化疗、靶向治疗等方法，才能获得较好控制率，延长生存期。
[0004] 在过去的几十年里，虽然科学家们不断地探索非小细胞肺癌（NSCLC)化疗和放疗 的方法，但取得的成果仍不能令人满意，例如晚期肺癌患者的平均生存时间仍未超过一年， 疗效不确定，部分患者会出现一些毒副反应，如恶心、呕吐等胃肠道反应，影响了生活质量， 甚至中断治疗。传统的细胞毒性化学药物可比作是"杀敌一千，自损八百"，因而许多患者对 此是谈之色变，而靶向治疗正是科学家们几十年来致力于分辨癌细胞与正常细胞之间分子 生物学差异的临床研究成果。
[0005] 所谓靶向治疗，就是通过基因或分子的选择，有针对性地杀死恶性肿瘤细胞，而几 乎不影响正常细胞。这一划时代的生物肿瘤疗法的特点可以总结为4个字："高效低毒"。 一方面，祀向治疗大大提1? 了肿瘤治疗的疗效；另一方面，祀向治疗减少患者在治疗中的副 作用，提高生活质量。
[0006] 靶向治疗是指在分子生物学诊断的基础上，利用肺癌细胞和正常细胞之间存在 的差异，有针对性地抑制肺癌细胞生长和增殖，例如，采用拮抗受体、抑制肿瘤生长所需的 血管和阻断肿瘤生长的信号传导通路等方法来抑制肺癌细胞生长和增殖，从而达到治疗目 的。
[0007] ALK-EML4融合基因是肺癌靶向治疗新宠。ALK-EML4融合基因可见于多种肿瘤， 例如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神经细胞瘤和非小细胞肺癌（NSCLC) 等，它是由第2号染色体短臂片段颠换（inversion)引起。ALK-EML4的发现，代表了一种 NSCLC的分子亚型，该组患者具有独特的临床特征：不能从EGFR-TKI靶向治疗中获益。接 受EGFR-TKI治疗的野生型患者和ALK阳性患者相比，后者可能更容易产生耐药。ALK-EML4 的发现促使肺癌治疗朝向"个体化"的目标迈近了一步。虽然ALK-EML4融合基因仅有 4% -10%的阳性率，在ALK-EML4融合基因阳性的患者中，其抑制剂Crizotinib的疗效可达 60%以上。美国FDA迅速批准Crizotinib上市，对于ALK-EML4融合基因阳性的患者是个 福音。由于该基因较低的阳性率，所以在使用前应行基因检测，只有在阳性的患者中才建议 使用。
[0008] ALK基因，间变型淋巴瘤激酶基因，定位于染色体2p23。FISH可检测与ALK基因 相关的染色体易位，包括EML4、TFG和KIF5B及其他基因融合。雅培Vysis ALK双色分离 探针试剂盒是第一个针对非小细胞肺癌患者新型亚类的伴随诊断试剂，适用于福尔马林固 定、石蜡包埋的非小细胞肺癌组织切片样本。选择XALKORI (crizotinib)药物治疗的必要 条件是FISH检测ALK阳性的非小细胞肺癌。雅培Vysis ALK双色分离探针试剂盒和辉瑞 的XALKORI (crizotinib)同时获得美国FDA批准。另外，此探针也可用于间变型大细胞淋 巴瘤的辅助诊断。
[0009] 然而，目前美国FDA批准的ALK FISH检测试剂盒（雅培Vysis ALK双色分离探针 试剂盒）仅能检测ALK基因的断裂，但不能判断ALK断裂后是否和EMBL4发生融合，因此提 供给临床医生的信息不够全面，不利于肺癌的精确分子分型和靶向治疗。
【发明内容】
[0010] 本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种肺癌相关融合基因 FISH检测的改良方法，探针及试剂盒。该法设计周全，操作简单，特异性和敏感性高，可以快 速，准确，直观地测出肺癌相关ALK-EML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可作为医师对 肺癌进行分子分型的参考依据，适用于大规模推广应用。
[0011] 为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种肺癌相关融合基因多色 FISH检测方法，其特点是，对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用多色FISH探针 进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。
[0012] 较佳地，所述多色探针包括ALK 3'端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针 (位于断裂热点5'端），和EML4全长探针，其中ALK为SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列， EML4为SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0013] 更佳地，ALK基因3'端探针采用红色荧光素标记，ALK基因5'端探针采用绿色荧 光素标记，EML4基因探针采用蓝色突光素标记。
[0014] 在本发明的第二方面，提供了一种用于肺癌相关融合基因 FISH检测的多色FISH 探针，所述多色探针包括ALK 3'端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针（位于断裂 热点5'端），和EML4全长探针，其中ALK为SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，EML4为SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0015] 较佳的，所述ALK基因3'端探针采用红色荧光素标记，ALK基因5'端探针采用绿 色突光素标记，EML4基因探针采用蓝色突光素标记。
[0016] 在本发明的第三方面，提供了一种肺癌相关融合基因 FISH检测试剂盒，包括多色 探针，所述多色探针包括ALK 3'端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针（位于断裂 热点5'端），和EML4全长探针，其中ALK为SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列，EML4为SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。
[0017] 较佳的，所述ALK基因3'端探针采用红色荧光素标记，ALK基因5'端探针采用绿 色突光素标记，EML4基因探针采用蓝色突光素标记。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明的肺癌相关融合基因 FISH检测方法通过对肺癌 组织石蜡切片进行常规预处理，然后采用高分辩多色FISH进行原位杂交，根据检测到的荧 光信号判断是否存在所述肺癌相关融合基因。本法设计周全，操作简单，特异性和敏感性 高，可以快速，准确，直观检测出肺癌相关ALK-EML4融合基因，检测结果准确可靠，从而可 作为医师对肺癌进行精确分子分型的参考依据，适于大规模推广应用。
【具体实施方式】
[0019] 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。下列具体实施 例采用的主要试剂，仪器和操作步骤如下：
[0020] 实施例1
[0021] 一、探针DNA的获取
[0022] 1)划线接种：将携带有ALK基因和EML4的BAC菌种划线接种于含有抗生素（氯 霉素）的琼脂平板上，37°C培养过夜（约14小时）。
[0023] 2)初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素（氯 霉素）的LB液体培养基中，放入37°C摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6-8小时。
[0024] 3)过夜培养：每1ml菌液转移至200ml培养体系，放置于37°C摇床，转速200rpm， 培养过夜（约14-16小时）。
[0025] 4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
[0026] 二、探针标记
[0027] 1.酶切 DNA:
[0028] 1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
[0029]
【权利要求】
1. 一种肺癌相关融合基因 FISH检测方法，其特征在于，包括如下步骤：对肺癌组织石 蜡切片进行常规预处理，然后采用多色FISH探针进行原位杂交，根据检测到的荧光信号判 断是否存在所述肺癌相关融合基因。
2. 根据权利要求1所述的肺癌相关融合基因 FISH检测方法，其特征在于，所述多色探 针包括ALK 3'端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针（位于断裂热点5'端），和 EML4全长探针，其中ALK为SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4为SEQ ID NO :2所示的 核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的肺癌相关融合基因 FISH检测方法，其特征在于ALK基因3' 端探针采用红色荧光素标记，ALK基因5'端探针采用绿色荧光素标记，EML4基因探针采用 蓝色突光素标记。
4. 一种用于肺癌相关融合基因 FISH检测的多色FISH探针，其特征在于，包括ALK 3' 端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针（位于断裂热点5'端），和EML4全长探针。 其中ALK为SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4为SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
5. 根据权利要求4所述的用于肺癌相关融合基因 FISH检测的多色FISH探针，其特征 在于：ALK基因3'端探针采用红色突光素标记，ALK基因5'端探针采用绿色突光素标记， EML4基因探针采用蓝色突光素标记。
6. -种肺癌相关融合基因 FISH检测试剂盒，其特征在于，包括多色FISH探针，所述多 色FISH探针包括ALK 3'端探针（位于断裂热点3'端），ALK 5'端探针（位于断裂热点5' 端），和EML4全长探针。其中ALK为SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，EML4为SEQ ID NO : 2所示的核苷酸序列。
7. 根据权利要求6所述的肺癌相关融合基因 FISH检测试剂盒，其特征在于：ALK基因 3'端探针采用红色突光素标记，ALK基因5'端探针采用绿色突光素标记，EML4基因探针采 用蓝色荧光素标记。
【文档编号】C12N15/11GK104195258SQ201410470181
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】缪为民 申请人:江苏蒙特立生物技术有限公司