一种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹rna的重组溶瘤腺病毒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物药学领域，涉及一种携带靶向人源驱动蛋白——分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法。本发明提供一种全新的肝癌药物靶标——分裂期磷蛋白1，其弥补传统基因治疗药物靶标p53基因的广谱性；本发明还提供了一种表达针对分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒制备方法；同时本发明提供了该重组溶瘤腺病毒在制备癌症治疗药物中的应用。
【专利说明】-种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶 瘤腺病毒
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及生物药学领域，具体来说，涉及一种携带靶向人源驱动蛋白--分裂 期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法。
【背景技术】
[0003] 原发性肝癌在世界范围内每年约发病26万例。我国肝癌发病率约占全世界的40% 以上，每年新发病例约10余万。我国肝癌死亡率位居所有癌症死亡人数的第二位，每年约 有13万患者死于肝癌。传统外科切除和微创外科手术是目前主要的治疗手段。然而由于 肝部瘤体积过大、位置不佳以及肝功能储备不足等原因常常导致手术失败，再加上术后的 高复发率使得手术治疗肝癌往往达不到预期。而由于肝癌对化疗的不敏感性或易产生耐药 性等原因，单独运用化学疗法治疗肝癌的效果十分有限。因此，作为新兴的治疗手段，基因 疗法治疗肝癌被寄予厚望。
[0004] 目前，我国一类新药"今又生"一重组人P53腺病毒注射液，是世界上第一个以 重组腺病毒作为载体进行癌症基因治疗的上市药物，临床上主要用于治疗鼻咽癌、头颈部 鳞癌、喉癌等实体瘤。但这类以非复制型腺病毒载体携带抗癌基因的药物在临床应用上也 存在难以克服的不足之处。首先，以一类新药"今又生"为例，该药以抗癌基因 P53为靶点， 在肿瘤细胞中引入外源P53蛋白以达成抗癌作用。但现在已有很多文献报道，p53基因在一 半以上的癌症中失活，或者由于突变以及显性抑制作用，其抗癌作用失去甚至由抑癌基因 变为癌基因。如果不事先对病人进行基因诊断和预测，对占一半以上的P53基因失活或对 P53不敏感癌症患者使用这类药物，将很难实现其抗癌效果。因此，寻找p53替代抗癌通路 中的分子靶点，是目前应用基因疗法治疗癌症研究中的关键。第二，目前该类药物的病毒载 体缺乏较强的肿瘤靶向作用，使得药物难于在靶部形成聚集，欲提高药物局部浓度需加大 用药剂量，容易引起机体免疫反应造成不良后果；第三，由于其载体是非复制型病毒载体， 在感染肿瘤细胞后外源抗癌基因表达时间相对较短，往往在抗癌蛋白表达尚未形成有效的 抗癌浓度之前已经被机体所清除，导致基因治疗效果不佳。
[0005] 发明人在寻找肿瘤治疗的新靶点过程中，通过分析肝癌临床样本发现驱动蛋白家 族中的一个成员-分裂期磷蛋白1 (M-phase phosphoprotein 1，MPH0SPH1)基因，在绝 大多数肝癌组织中相比癌旁组织及非肝癌组织显著高表达。该结果以前未见国内外文献报 道。基于RNA干扰（RNAi)技术，发明人构建了表达MPH0SPH1的小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)的重组腺病毒载体（以下简称为Ad-shMPPl，如图1所示)，该重组腺病毒能在小 鼠体内下调肝癌细胞内源MPH0SPH1的表达，显著阻滞细胞有丝分裂，并同时诱导多倍体细 胞的形成，最终诱导肝癌细胞发生衰老及有丝分裂后凋亡，与传统P53信号通路相比具有 不同的抗癌机制。动物体内结果显示，静脉注射该重组腺病毒，不仅能显著抑制小鼠原位肝 癌的发生，恢复动物由于肝癌所导致的肝损伤，且能显著提升肝癌对于化疗药物紫杉醇的 敏感性，产生协同抗癌作用，显示了良好的临床应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的的第一个问题在于提供一种全新的肝癌药物靶标--分裂期 磷蛋白1，其弥补传统基因治疗药物靶标P53基因的广谱性；本发明所要解决的第二个问题 是提供了一种表达针对分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒及其制备方法；本 发明所要解决的第三个问题，是提供了该重组溶瘤腺病毒在制备癌症治疗药物中的应用。
[0007] 本发明提供了一种携带靶向人源的驱动蛋白分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的重 组溶瘤腺病毒Ad-shMPPl的构建方法，与野生型腺病毒相比，该重组溶瘤腺病毒由肿瘤特 异性启动子--存活素启动子替换病毒复制必需基因 E1A的启动子，删除复制非必需基因 E1B55KD，并插入分裂期磷蛋白1的小发夹RNA的表达框(如图1所示)，其具体方案如下： 步骤一，质粒PSP-A55/ shMPPl的构建 1) 用油<31和fe?HI限制性内切酶，双酶切消化pXC2质粒，回收1170 kp片段并克隆 到经同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒pXC2-A55 ; 2) 以HEK293细胞基因组DNA为模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'（SEQ ID No 1)， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，（SEQ ID No 2)， 经PCR扩增，得到含人269 bp存活素（survivin)基因的启动子部分片段，并克隆到 PTG19-T载体上，构成质粒pTG19-SP ; 3) pTG19-SP经ZAoI andfe/I双酶切，回收280 bp片段并克隆到pXC2-A55的 限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒PSP-Λ 55 ; 4) 合成如下两条寡聚核苷酸： 正向：5, -GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3'（SEQ ID No 3)， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3， (SEQ ID No 4)， 分别退火，克隆到经如al/feoRI双酶切的pBS/U6载体上，其中经T4 DNA聚合酶 处理成平端，得到质粒pBS/U6-shMPPl ; 5) pBS/U6-shMPPl经消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表达框的片段并克隆到 pSP-Λ 55的你"/11位点上得到质粒pSP-shMPPl-Λ 55 ; 步骤二，同源重组法构建重组溶瘤腺病毒 6孔板每孔铺入4.0 X105人胚肾细胞系--HEK293细胞，共转染穿梭质粒 pSP-shMPPl- Λ 55与大质粒pBHGE3,二周之后观察细胞状态直至产生空斑； 步骤三，病毒收集纯化 从空斑中挑选病毒单克隆，鉴定后大规模复制病毒，收集细胞培养物，经氯化铯密度梯 度离心纯化病毒。
[0008] 本发明重组腺病毒Ad-shMPPl作为肝癌基因治疗的新型载体其突出优点有三点， 首先，其靶标分子--分裂期磷蛋白1是发明人在肝癌中发现的一个全新的癌基因，该蛋白 在细胞分裂末期中的胞质分裂过程中起着至关重要的作用。使用小发夹RNA能够极大的 抑制该蛋白活性，阻止肝癌细胞有丝分裂，显著抑制肝癌的发生和发展，并且与抗细胞微管 类化疗药物(其药物机理也是抑制细胞分裂）联用，如紫杉醇，会显著降低肝癌对紫杉醇的 药物抵抗，产生显著的协同抗癌作用，在临床上对于应用化疗治疗肝癌具有较好的促进作 用；第二，Ad-shMPPl能显著改善由于肝癌所导致的肝损伤，这一突出优点使得靶向分裂期 磷蛋白1的肝癌基因治疗在临床应用上尤其具有积极意义。总所周知，目前临床上治疗肝 癌第一选择是外科手术，但是由于种种原因，特别是由于肝癌患者肝功能储备不足而难以 实施手术。因此，如果能在治疗肝癌，缩小瘤体积的同时恢复病人肝功能储备，对于病人进 一步的积极治疗，比如说手术切除，肝移植等具有极其重要的意义；第三，Ad-shMPPl使用 的是肿瘤特异复制性重组腺病毒。该病毒在野生型腺病毒的基础上替换病毒复制必需基因 E1A的启动子为肿瘤特异性启动子存活素启动子，并删除了病毒在正常细胞中复制必需基 因 E1B55KD，使得病毒复制严格限制在肿瘤细胞中，而在正常细胞中不复制，在提高基因治 疗效果的同时也提高了其对正常组织的安全性，克服了以往使用非复制型病毒作为基因治 疗载体的一系列不足之处。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1为腺病毒基因组结构示意图，上排为野生型腺病毒，下排为Ad-shMPPl。
[0010] 图2为Ad-shMPPl抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的发生。
[0011] 图3为Ad-shMPPl显著降低动物血中谷草转氨酶指标并提高白蛋白指标。
[0012] 图4为Ad-shMPPl抑制动物皮下移植瘤，并显示和紫杉醇具有协同抗癌作用。
[0013] 图5为重组溶瘤腺病毒在肝癌细胞中特性复制，并特异性在肿瘤细胞中大量表达 外源报告基因。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和实施例进一步说明本发明。
[0015] 实施例1 :重组腺病毒Ad-shMPPl的构建方法 质粒pSP- Λ 55/ shMPPl的构建 1)用油<31和fe?HI限制性内切酶，双酶切消化pXC2质粒，回收1170 kp片段并克隆 到经同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒pXC2-Λ 55。
[0016] 2)以ΗΕΚ293细胞基因组DNA为模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，， 经PCR扩增，得到含人269 bp存活素（survivin)基因的启动子部分片段，并克隆到 PTG19-T载体上，构成质粒pTG19-SP。
[0017] 3)pTG19-SP 经ZAoI and 5^1 双酶切，回收 280 bp 片段并克隆到 PXC2-A55 的 1限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒pSP- Λ 55。
[0018] 4)合成如下两条寡聚核苷酸： 正向：5，-GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3，， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3，， 分别退火，克隆到经如al/feoRI双酶切的pBS/U6载体上，其中经T4 DNA聚合酶 处理成平端，得到质粒pBS/U6-shMPPl。
[0019] 5)pBS/U6-shMPPl经汉·ΗΙ消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表达框的片段并克 隆到pSP-Λ 55的你/II位点上得到质粒pSP-shMPPl-Λ 55。
[0020] 6孔板每孔铺入4. 0 X 105人胚肾细胞系--HEK293细胞，待细胞密度到80%左 右进行质粒转染。转染时，将上步得到的穿梭质粒pSP-shMPPl-Λ 55与大质粒pBHGE3按 照质量比2:1混合，每孔加入1. 5 μ g DNA并补加 Buffer EC至总体积100 μ 1，然后加入 12 μ 1 Enhancer,震荡混勻；室温放置5分钟离心；加入15 μ 1 Effectene Transfection Reagent，吹打混匀，室温放置20分钟；向转染复合物中加入600 μ 1完全培养基，混匀后加 入孔中，并轻轻摇动平板是复合物均匀混合。37°C培养6-18小时后换液。继续培养48小 时后，吸干培液并在每孔中加入2ml低熔点琼脂糖（1. 25% agarose，7. 5% FBS)，等琼脂糖 凝固后转移至培养箱。之后观察细胞状态直至产生空斑。
[0021] 从空斑中挑选病毒单克隆，经过PCR鉴定后进行大规模培养，收集细胞培养物，经 氯化铯密度梯度离心纯化病毒。具体操作过程如下： 将293细胞铺于50-80个10cm培养皿，待细胞密度达到90%以后，每块板感染合适滴度 的病毒，待细胞全部病变后（4-7天），每块板中加入约500 μ? 10% Nonidet P 40 (NP40) 裂解液以裂解细胞。收集整个细胞裂解物，12000 rpm离心10分钟，弃细胞碎片，收集上清。 每 100 ml 上清加入 50 ml PEG8000 (20% PEG8000，2.5M NaCl)，冰上 2 小时沉淀病毒。 12000 rpm离心上述混合物20分钟，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml密度为1. 10g/ml的氯 化铯溶液中（溶剂为20 mM Tris-Hcl，pH 8. 0) 4°C 7000 rpm低温离心5分钟，收集病毒 悬浮液。氯化铯密度梯度溶液的制备：加入2. 0 ml的氯化铯（密度1. 40 g/ml，溶剂同上）， 再加入3.0 ml密度为1.30 g/ml的氯化铯溶液，再加入5 ml的病毒悬浮液。20000 rpm， 室温离心2小时。收集密度在1. 30-1. 40g/ml之间的病毒条带至透析袋中，透析袋用前用 10 mM的EDTA溶液煮沸10分钟。在透析缓冲液（0. 15M蔗糖，0. 01M Tris-HCl pH 8. 0,2mM MgCl2)中，4°C透析过夜，中间换一次透析液。收集病毒，冻存于_80°C。三种密度的CsCl溶 液配制（溶于灭菌20 mM Tris, ρΗ8· 0)如下： 表1三种密度的氯化铯溶液配方
【权利要求】
1. MPH0SPH1在作为肝癌基因治疗药物靶标上的应用。
2. -种携带靶向分裂期磷蛋白1基因的小发夹RNA的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其 特征在于，包括如下步骤： 步骤一，质粒PSP-A55/ shMPPl的构建 用油al和fe?HI限制性内切酶，双酶切消化pXC2质粒，回收1170 kp片段并克隆到经 同样双酶切的PZD55载体中，构建成质粒pXC2-A55 ; 以HEK293细胞基因组DNA为模板，引物如下： 正向：5, -ATG AAT TCC GCG TTC TTT GAA AGC AG-3'， 反向：5, -AAT CTC GAG TGC CGC CGC CGC CAC CT-3，， 经PCR扩增，得到含人269 bp存活素基因的启动子部分片段，并克隆到pTG19-T载体 上，构成质粒PTG19-SP ; 3. pTG19-SP经ZAoI andfe/I双酶切，回收280 bp片段并克隆到pXC2-A55的 限制性位点，经过鉴定存活素基因启动子的方向，得到质粒PSP-Λ 55 ; 4) 合成如下两条寡聚核苷酸： 正向：5，-GTGAAGAAGTGCGACCGAAGAAGACTTCGGTCGCACTTC TTCACCTTTTTG-3，， 反向：5, -AATTCAAAAAGGTGAAGAAGTGCGACCGAAGTCTTCTTC GGTCGCACT TCTTCAC-3，， 分别退火，克隆到经如al/feoRI双酶切的pBS/U6载体上，其中经T4 DNA聚合酶 处理成平端，得到质粒pBS/U6-shMPPl ; 5. pBS/U6-shMPPl经消化，回收400 bp包含U6/shMPPl表达框的片段并克隆到 pSP-Λ 55的你"/11位点上得到质粒pSP-shMPPl-Λ 55 ; 步骤二，同源重组法构建重组溶瘤腺病毒 6孔板每孔铺入4.0 X105人胚肾细胞系--HEK293细胞，共转染穿梭质粒 pSP-shMPPl- Λ 55与大质粒pBHGE3,二周之后观察细胞状态直至产生空斑； 步骤三，病毒收集纯化 从空斑中挑选病毒单克隆，鉴定后大规模复制病毒，收集细胞培养物，经氯化铯密度梯 度离心纯化病毒。
3. 权利要求2所构建的重组溶瘤腺病毒在制备治疗肝癌药物中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK104195117SQ201410470155
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】黄昆, 刘欣然, 郑凌, 吴琼 申请人:武汉百奥京生物医药有限公司